楊曉桐, 那 日, 鄭 宇, 李 韜, 唐雅婷

(內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

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高壓電暈電場(chǎng)對(duì)出芽短梗霉菌誘變的研究

楊曉桐, 那 日*, 鄭 宇, 李 韜, 唐雅婷

(內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

[目的] 通過(guò)研究高壓電暈電場(chǎng)誘變對(duì)出芽短梗霉多糖產(chǎn)量的影響，篩選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的出芽短梗霉菌株。[方法] 采用高壓電暈電場(chǎng)對(duì)出芽短梗霉進(jìn)行誘變，在臨界放電電壓下誘變不同時(shí)間，測(cè)定出芽短梗霉的性狀和多糖產(chǎn)量的變化。[結(jié)果] 在臨界放電電壓4.4 kV下的最佳誘變時(shí)間是60 min; 經(jīng)過(guò)2次連續(xù)誘變，多糖產(chǎn)量達(dá)到9.57 g/L，是原始菌株的3倍多，發(fā)酵液顏色為米白色，最終pH為4.2左右; 連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，其生狀和產(chǎn)量無(wú)明顯變化，傳代穩(wěn)定。[結(jié)論]高壓電暈電場(chǎng)對(duì)出芽短梗霉菌的普魯蘭產(chǎn)量提高有顯著作用。

出芽短梗霉；高壓電暈電場(chǎng)；普魯蘭

出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)屬于半知菌類(lèi)短梗霉屬，是一種具有酵母型和菌絲型兩種形態(tài)的真菌，而短梗霉多糖是一種由出芽短梗霉發(fā)酵而來(lái)的胞外水溶性多糖，也稱(chēng)作普魯蘭(Pullulan)。它無(wú)色無(wú)味，具有眾多優(yōu)秀的理化特性，在食品、環(huán)境、包裝以及醫(yī)藥領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景[1]，但目前生產(chǎn)成本偏高，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)。除去生產(chǎn)方式的因素之外，最重要的還是沒(méi)有優(yōu)質(zhì)而高產(chǎn)的菌株。筆者將通過(guò)采用高壓電暈電場(chǎng)誘變的方式篩選出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的出芽短梗霉菌。

1 材料與方法

1.1 菌種的選擇 試驗(yàn)采用由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心培育的出芽短梗霉。

1.2 菌種的活化 采用PDA培養(yǎng)基，組成為：馬鈴薯200 g、蔗糖 20 g、去離子水 1 000 ml，不需要調(diào)整pH， 121 ℃滅菌20 min。在超凈工作臺(tái)進(jìn)行接種，將少量菌粉接入液體的PDA培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖瓶發(fā)酵36～48 h。

1.3 菌種生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 菌種的生長(zhǎng)采用液體種子培養(yǎng)基，組成為：蔗糖30.0 g/L、酵母膏2.00 g/L、 K2HPO46.30 g/L、NaCl 1.00 g/L、 MgSO4·7H2O 0.20 g/L、(NH4)2SO40.60 g/L，去離子水1 000 ml，pH 6.4～6.8，115 ℃滅菌30 min。將活化36 h的菌種接入種子培養(yǎng)基中，按10%的比例接入，根據(jù)比濁法測(cè)量其生長(zhǎng)曲線，每隔2 h測(cè)定其吸光值(OD)。該次試驗(yàn)選取波長(zhǎng)為600 nm[2]。

1.4 菌種發(fā)酵周期的測(cè)定 為了測(cè)定合適且準(zhǔn)確的普魯蘭多糖產(chǎn)量，需要測(cè)定出芽短梗霉菌種的發(fā)酵周期。將活化后的菌種接入液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔24 h取出，測(cè)定多糖和生物量。

1.5 菌種的誘變 采取高壓電暈電場(chǎng)即單針板電極，對(duì)出芽短梗霉菌種進(jìn)行誘變。將活化36～48 h的菌種接入液體種子培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，一定時(shí)間后將達(dá)到對(duì)數(shù)期的菌液轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的錐形瓶?jī)?nèi)，200 r/min振蕩15 min，以達(dá)到打碎孢子團(tuán)塊的目的，振蕩結(jié)束后用脫脂棉過(guò)濾，得到孢子濃度約107個(gè)/ml的單孢子懸液[3]。

將制備好的單孢子懸液用移液槍接入已滅菌的培養(yǎng)皿中。由于不同的菌液厚度會(huì)影響電暈電場(chǎng)的放電情況，為保證除誘變時(shí)間外的其他變量相同，故取每個(gè)培養(yǎng)皿均承接菌懸液10 ml，分別標(biāo)記為P-0、P-1、P-2、P-3、P-4、P-5、P-6，其中P-0為不進(jìn)行誘變的對(duì)照組。由于在放電情況下電壓激增，客觀條件不易控制，故誘變電壓選取為臨界放電電壓。在此電壓下，誘變時(shí)間依次為10、20、30、40、50、60 min。誘變時(shí)針尖與液面距離定為1 cm。該試驗(yàn)環(huán)境的臨界放電電壓為4.4 kV。

誘變后用平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，測(cè)定致死率。

致死率 =(未誘變的原始總菌株- 誘變后的存活菌數(shù))/ 未誘變的總菌數(shù)×100%

1.6 菌種的篩選 誘變后，對(duì)菌種進(jìn)行初篩，將菌液稀釋?zhuān)坎计桨澹?8 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落的大小、顏色以及菌落形態(tài)。挑選出菌落直徑大、菌落顏色淺、周邊呈稠厚膠狀的菌株，這樣的菌株生長(zhǎng)與產(chǎn)膠性能皆為優(yōu)良[4]。同時(shí)，篩選、淘汰菌落直徑偏小且周?chē)稍?、多絨毛的菌株。

在初篩完成后對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)篩。將挑選出來(lái)的優(yōu)質(zhì)菌株和未誘變的菌株分別接入液體種子培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)一個(gè)發(fā)酵周期，觀察發(fā)酵液顏色，測(cè)定其生物量和多糖產(chǎn)量，比較誘變后菌株多糖產(chǎn)量是否多于未誘變的原始菌株，若超過(guò)原始菌株，則作為誘變結(jié)果良好的正突變株保存，并且進(jìn)行下一步的連續(xù)培養(yǎng)和誘變。

1.7 生物量和多糖產(chǎn)量的測(cè)定 將28 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)一個(gè)發(fā)酵周期的發(fā)酵液高溫滅酶20 min，8 000 r/min 離心15 min，將沉淀在95 ℃的高溫烘干機(jī)中干燥脫水至恒重，即為菌種干重。

向離心得到的上清液中加入2倍體積的濃度95%乙醇溶液，在4 ℃的冰箱中放置過(guò)夜，使得普魯蘭達(dá)到充分的沉淀，然后4 500 r/min離心20 min，棄掉上清液，將沉淀用乙醇洗滌過(guò)后，干燥至恒重，得到短梗霉多糖，稱(chēng)重，計(jì)算產(chǎn)量[5]。

1.8 連續(xù)誘變優(yōu)質(zhì)菌株 為了盡可能多地提高出芽短梗霉的普魯蘭產(chǎn)量，選擇對(duì)第1次誘變篩選出的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)菌株進(jìn)行第2次的連續(xù)電場(chǎng)誘變。將挑選出的優(yōu)質(zhì)菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后在臨界放電電壓4.4 kV下進(jìn)行誘變，誘變時(shí)間為第1次誘變選擇出的最佳誘變時(shí)間，然后稀釋涂布平板，進(jìn)行初篩和復(fù)篩。

1.9 遺傳穩(wěn)定性 將挑選出的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)菌株連續(xù)培養(yǎng)10代，觀察其多糖產(chǎn)量和性狀的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 出芽短梗霉的生長(zhǎng)曲線 由圖1可知，經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)36～48 h的出芽短梗霉遲滯期較短，在液體種子培養(yǎng)基中可以很快速地生長(zhǎng)和繁殖，恒溫?fù)u床培養(yǎng)4 h后就可以進(jìn)入菌種生長(zhǎng)最旺盛的對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)18 h之后逐漸趨于平衡，進(jìn)入穩(wěn)定期。處于對(duì)數(shù)期的菌種十分活躍，突變率高，重現(xiàn)性好，適合進(jìn)行誘變育種，故得出最佳誘變時(shí)間為培養(yǎng)4～16 h。該試驗(yàn)選擇搖床培養(yǎng)14 h的出芽短梗霉進(jìn)行誘變。

2.2 發(fā)酵周期的測(cè)定 隨著發(fā)酵時(shí)間的變長(zhǎng)，菌液的顏色由透明淺黃色逐漸變?yōu)辄S綠色直至黑綠色。由圖2可知，菌種生物量和多糖含量均逐漸增加，在第6～7天達(dá)到飽和，所以在測(cè)定出芽短梗霉的普魯蘭產(chǎn)量時(shí)，應(yīng)將菌種的發(fā)酵周期定為6～7 d，此時(shí)多糖產(chǎn)量最高。

2.3 致死率的測(cè)定 由圖3可知，菌種的致死率隨著誘變時(shí)間的增加而逐漸增加。這說(shuō)明誘變的電壓大小選取是合適且正向有效的。為了提高菌種誘變的成功率，使其突變特性好，選取60 min為最佳誘變時(shí)間。

2.4 菌種的初篩 由表1可知，變異菌株普遍比原始菌株的菌落大，且菌落顏色相對(duì)P-0菌株較淺。

表1 原始菌株和變異菌株的菌落特征

2.5 多糖和生物量的測(cè)定 由表2可知，編號(hào)為P-6-c的菌株產(chǎn)糖量較高，超出原始菌株2倍多。經(jīng)初篩，挑選出的P-6-c的菌落顏色較淺，沒(méi)有生成過(guò)多色素，變異特性較好。

表2 普魯蘭多糖產(chǎn)量分析

2.6 二次誘變初篩 由表3可知，二次誘變挑選出的菌株菌落顏色都較淺，黑色素的生成較少，將變異菌株接入液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的顏色也與菌落顏色接近，基本靠近白色。

2.7 二次誘變多糖和生物量的測(cè)定 由表4可知，編號(hào)為P-6-c-Ⅰ的菌落大小明顯大于出發(fā)菌P-0，且多糖產(chǎn)量經(jīng)過(guò)2次誘變達(dá)原始菌株的3倍多，達(dá)到了提升多糖產(chǎn)量的目的。

表3 P-6-c菌株和變異菌株的菌落特征

表4 普魯蘭多糖產(chǎn)量

2.8 遺傳穩(wěn)定性測(cè)試 為了保證菌株的多糖產(chǎn)量穩(wěn)定，將P-6-c-Ⅰ號(hào)菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，分別測(cè)定多糖產(chǎn)量和pH。由表5可知，該變異菌株的多糖產(chǎn)量沒(méi)有太大變化，發(fā)酵液最終顏色為米白色，pH為4.2～4.4。

表5 普魯蘭多糖產(chǎn)量分析

3 結(jié)論與討論

自從1938年Bauer發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉可以產(chǎn)生一種黏性物質(zhì)[6]，并在1959年被定義為普魯蘭后，國(guó)內(nèi)外的科研工作者們對(duì)普魯蘭的研究一直沒(méi)有停止過(guò)。對(duì)于普魯蘭的研究主要有幾個(gè)方面：優(yōu)化培養(yǎng)基的組成，探索最佳的發(fā)酵條件；高產(chǎn)低色素菌株的誘變篩選；工業(yè)化生產(chǎn)降低成本以及對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和應(yīng)用的研究。其中，高產(chǎn)低色素菌株的誘變篩選一直是較根本的問(wèn)題。在國(guó)內(nèi)，高產(chǎn)低色素的出芽短梗霉菌株難以獲得且發(fā)酵周期長(zhǎng)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過(guò)高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。目前，對(duì)于出芽短梗霉，常見(jiàn)的誘變方式有利用紫外線、亞硝酸和硫酸二乙酯(DES)等誘變劑來(lái)對(duì)菌種進(jìn)行誘變[7-9]，而對(duì)于物理性方法研究得較少。該研究首先對(duì)出芽短梗霉搖床培養(yǎng)，確定誘變的最佳時(shí)間為4～16 h，并且通過(guò)測(cè)定多糖和生物量，確定菌種的發(fā)酵周期，然后在菌種的對(duì)數(shù)期進(jìn)行高壓電暈電場(chǎng)誘變，實(shí)現(xiàn)多糖的提高，由P-0號(hào)菌株的3.13 g/L提高至P-6-c-Ⅰ號(hào)菌株的9.57 g/L，變化顯著。試驗(yàn)中，出芽短梗霉黑色素的生成降低，菌落顏色由最開(kāi)始的黑灰色變成米白色。對(duì)比國(guó)內(nèi)外的一些先進(jìn)研究成果，還有一定差距。分析原因，可能是原始菌種的選擇不同，出發(fā)菌多糖產(chǎn)量相對(duì)較低。但是，采用電暈電場(chǎng)誘變的方法的確是有效可行的，以后若采取更多方式復(fù)合誘變，則可達(dá)到更好的預(yù)期效果。研究表明，以P-0為出發(fā)菌，對(duì)P-0進(jìn)行高壓電暈電場(chǎng)誘變，在臨界放電電壓4.4 kV下誘變60 min。經(jīng)過(guò)2次連續(xù)誘變，多糖產(chǎn)量達(dá)9.57 g/L，是原始菌株P(guān)-0的3倍多，發(fā)酵液顏色為米白色，最終pH為4.2左右，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，其性狀和產(chǎn)量無(wú)明顯變化，傳代穩(wěn)定。

[1] 楊西江,徐田華,徐玲,等.普魯蘭多糖的應(yīng)用及研究生產(chǎn)現(xiàn)狀[J].發(fā)酵科技通訊,2010,39(4):25-28.

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Study on Aureobasidium Pullulans Mutation by High Voltage Pulsed Electric Field

YANG Xiao-tong, NA Ri*, ZHENG Yu et al

(School of Physical Science and Technology，Inner Mongolia University, Hohhot, Inner Mongolia 010021)

[Objective] The effects of corona treatment on pullulan production were studied to screenAureobasidiumpullulanswith high yield and good quality. [Method] Using mutagenesis ofAureobasidiumpullulansby corona, different time at the critical discharge voltage was processed，and the change ofAureobasidiumpullulanstraits and yield of polysaccharides were determined.[Result] The best mutation time in critical voltage 4.4 kV was 60 min. After two consecutive mutagenesises, the polysaccharide production reached 9.57 g/L, more than three times of the original strain. Fermentation liquor color was white, and the final pH was about 4.2. After continuous passage culture of 10 generation, its shape and the yield had no obvious change, and the passage was stable. [Conclusion] Corona had a significant effect on the improvement of the yield of pullulan.

Aureobasidiumpullulans; High voltage pulsed electric field; Pullulan

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.51267014)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(No.201310126043)。

楊曉桐(1994- )，女，四川廣安人，本科生，專(zhuān)業(yè)：生物物理。*通訊作者，教授，從事生物物理方面的研究。

2015-04-23

S 12

A

0517-6611(2015)17-003-02