王攀婷，厲威池，孫 旭，馬成學(xué)

(東北林業(yè)大學(xué)濕地科學(xué)系，黑龍江哈爾濱 150000)

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汞和農(nóng)藥氯氰菊酯對蛋白核小球藻的復(fù)合污染急性毒性

王攀婷，厲威池，孫 旭，馬成學(xué)*

(東北林業(yè)大學(xué)濕地科學(xué)系，黑龍江哈爾濱 150000)

采用實驗室培養(yǎng)方法，研究不同濃度的Hg2+和不同濃度的農(nóng)藥氯氰菊酯單獨及聯(lián)合作用對蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，Hg2+和氯氰菊酯單獨作用時，較低濃度的Hg2+(小于5 μg/L)和氯氰菊酯(小于2 mg/L)對小球藻無明顯抑制作用，但隨著濃度增大，抑制作用增強。且半效應(yīng)濃度(EC50)值均隨時間的延長而減??；二者聯(lián)合作用時，隨著時間延長，EC50與污染物質(zhì)單獨作用時的趨勢相同，EC50-24 h為2.366 mg/L，EC50-96 h為1.711 mg/L，存在明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系。并且根據(jù)水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)法得出，低濃度和高濃度組均表現(xiàn)拮抗作用，Hg2+與氯氰菊酯的同時存在降低了兩者對蛋白核小球藻的生長抑制作用。

蛋白核小球藻；Hg2+；氯氰菊酯；復(fù)合污染；拮抗作用

近年來重金屬汞和農(nóng)藥的排放越來越嚴(yán)重，嚴(yán)重污染水生態(tài)系統(tǒng)，尤其是淡水生態(tài)系統(tǒng)。浮游植物作為水域初級生產(chǎn)力在水生態(tài)系統(tǒng)中起著不可替代的作用。國內(nèi)開展了很多的相關(guān)研究，但絕大多數(shù)都是研究單一方面對浮游植物的影響，而在淡水生態(tài)系統(tǒng)中重金屬污染物和農(nóng)藥污染常常同時存在，它們的作用顯然是復(fù)合污染。重金屬和農(nóng)藥單一方面的毒性試驗顯然不能完全客觀地反映污染物對淡水生態(tài)系統(tǒng)中浮游植物的影響，因此，有必要研究它們的復(fù)合污染毒性效應(yīng)。

目前，關(guān)于重金屬汞和農(nóng)藥對蛋白核小球藻生長的影響有較多研究報道，但關(guān)于汞和氯氰菊酯對蛋白核小球藻的復(fù)合污染毒性效應(yīng)的研究尚未見報道。為此，筆者以蛋白核小球藻為例，研究了汞和氯氰菊酯對浮游植物的急性毒性和復(fù)合污染毒性效應(yīng)，以期為多種污染物的復(fù)合污染效應(yīng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物。蛋白核小球藻由中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫提供，采用SE藻類培養(yǎng)液配方培養(yǎng)，引種680 nm波長下測定吸光度值為0.20的活性藻種1 ml，培養(yǎng)溫度為(28±1)℃，光照強度為10 000 lux，在500 ml 錐形瓶中連續(xù)光照下培養(yǎng)8 d，至吸光度值達到0.08時開始加入汞和氯氰菊酯。

1.1.2 供試藥劑。4.5%高效氯氰菊酯為天津市匯源化學(xué)品有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗。在處于指數(shù)生長期的藻類培養(yǎng)液中，將氯化汞配制成Hg2+濃度為0、5、10、50、100、1 000 μg/L 6個不同濃度梯度，每個濃度設(shè)3個平行，不充氣條件下每日搖勻3次。在處于指數(shù)生長期的藻類培養(yǎng)液中，將4.5%高效氯氰菊酯用丙酮配制成0、1、2、3、4、5 mg/L 6個不同濃度梯度，空白組加入相同濃度丙酮。復(fù)合污染毒性試驗在單一毒性基礎(chǔ)上按1∶1單位添加進行6個不同濃度的梯度試驗。

1.2.2 復(fù)合污染毒性評價。試驗得到單一毒性和復(fù)合污染毒性的EC50后，采用修瑞琴等[1]的水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)法計算進行評價。

S=Am/A1+Bm/B1

式中，S為對蛋白核小球藻毒性相加之和；A1、B1為單一污染物的EC50；Am、Bm為復(fù)合污染下的EC50。當(dāng)S<1時，相加指數(shù)AI=1/S-1.0；當(dāng)S> 1時，相加指數(shù)AI=S(-1)+ 1.0。最后根據(jù)AI的結(jié)果評價復(fù)合污染效應(yīng)，AI>0 為協(xié)同作用；AI<0 為拮抗作用；AI=0 為相加作用。

1.2.3 藻細胞EC50的計算。特定生長率(U)由公式(1)計算，生長抑制百分率(EC)定義為氯氰菊酯抑制生長率的百分比，計算公式為式(2)，EC50值采用抑制百分率的概率單位-濃度對數(shù)直線回歸法進行計算，并計算EC50的95%可信限范圍。

U=ln(Nt/N0)/t

(1)

EC=(U0-Ui)/U0×100%

(2)

式中，U為特定生長率(d-1)；N0為初始細胞密度(個/ml)；Nt為培養(yǎng)t天時的細胞密度(個/ml)；U0是對照組的特定生長率；Ui是試驗組的特定生長率。

2 結(jié)果與分析

2.1 汞和氯氰菊酯對蛋白核小球藻的單一和復(fù)合毒性

由圖1～3可知，在不同濃度汞和氯氰菊酯的暴露下，蛋白核小球藻的生長受到不同程度的影響。相同時間下不同汞處理濃度組藻細胞均顯著降低，且隨著汞濃度的升高，對蛋白核小球藻的抑制更顯著。相同條件下，低濃度(1 mg/L)的氯氰菊酯組對藻細胞抑制不明顯，濃度超過2 mg/L以后隨著氯氰菊酯濃度的增加，對蛋白核小球藻的抑制更顯著。汞和氯氰菊酯復(fù)合污染下不同處理組藻細胞均顯著降低。

2.2 汞和氯氰菊酯對蛋白核小球藻的復(fù)合污染毒性(EC50)

由表1可知，汞和氯氰菊酯單獨作用時，EC50值均隨時間的延長而減?。欢呗?lián)合時，隨著時間的延長，EC50與污染物質(zhì)單獨作用時的變化趨勢相同，24 h時的EC50值為2.366 mg/L，96 h時的EC50值為1.711 mg/L，存在明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系。

表1 汞和氯氰菊酯對蛋白核小球藻的復(fù)合污染毒性

2.3 水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)

由表2可知，低濃度和高濃度組均表現(xiàn)為拮抗作用，表明Hg2+與氯氰菊酯的同時存在降低了兩者對蛋白核小球藻的生長抑制作用?？赡苁且驗閮烧咴谠寮毎麅?nèi)發(fā)生生理反應(yīng)，引起了藻細胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)、葉綠素等水平變化，從而表現(xiàn)拮抗作用。

表2 水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)

3 討論

3.1 重金屬汞對蛋白核小球藻的毒性作用

近年來隨著水體重金屬污染的加重，人們對其的研究也越來越多，高濃度的重金屬對藻類均有抑制作用[2]，這是因為重金屬離子造成藻細胞線粒體損傷，影響了光合作用的電子傳遞系統(tǒng)，阻礙了蛋白質(zhì)合成，從而抑制了藻類生長[3-4]，5種對生物毒性最大的重金屬汞、鎘、鉻、鉛、砷中，對浮游植物影響最大的為汞。汞對浮游植物的毒害作用主要是通過與重要的生物大分子的功能基團相結(jié)合，擾亂質(zhì)膜正常結(jié)構(gòu)，影響營養(yǎng)離子的轉(zhuǎn)運，從而破環(huán)細胞正常的生理功能。離子態(tài)汞可以直接結(jié)合琉基蛋白的-SH基團，改變磷酸基團與活性基團ADP或ATP之間的反應(yīng)親和性，改變膜的透性等[5]。另一方面，汞可以促進活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生和積累，對浮游植物造成氧化脅迫，進而誘發(fā)細胞膜脂、核酸及細胞色素等變性失活，加大細胞脂質(zhì)過氧化水平，并且影響光合作用的電子傳遞系統(tǒng)，導(dǎo)致光合色素損害和葉綠素含量下降[6-8]。對于不同門類的藻類，汞對硅藻生長抑制最明顯，對藍藻生長則表現(xiàn)為低濃度促進、高濃度抑制的Hormesis效應(yīng)?？赡苁羌毎趦?nèi)的有機物(如多糖組成的膠鞘、膠被或黏液等胞外多糖)通常能絡(luò)合重金屬離子，從而使金屬離子不能進入細胞內(nèi)部[9-10]。也有研究證明，藻類細胞內(nèi)部尚有一套保護系統(tǒng)可解除有毒物質(zhì)的毒素，該解毒作用使重金屬形成有機金屬化合物沉淀下來[11]。對于綠藻門的不同種類來說，汞對蛋白核小球藻的生長抑制明顯大于對柵藻的抑制，從該研究結(jié)果來看，汞對蛋白核小球藻的24 h半致死濃度(36.98 μg/L)明顯低于汞對柵藻的24 h半致死濃度(1.9 mg/L)。汞對蛋白核小球藻的EC50值表現(xiàn)為隨著處理時間的延長而減小，存在劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。

3.2 農(nóng)藥氯氰菊酯對蛋白核小球藻的毒性作用

除蟲菊酯類殺蟲劑由于其高效、低毒、廣譜、光穩(wěn)定性好等特點，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林生產(chǎn)中，造成大量菊酯類農(nóng)藥經(jīng)地表徑流流入江、河、湖泊等水體，同時對生活于水體中的浮游植物產(chǎn)生深遠影響。因水生藻類具有個體小、繁殖快、易獲得、對農(nóng)藥高度敏感等特點，所以農(nóng)藥對其影響較明顯。通常低濃度的農(nóng)藥可作為藻類生長的營養(yǎng)源，促進藻類生長，相反，高濃度則抑制藻類生長[12]。Perona等[13]發(fā)現(xiàn)低濃度(<1.0 mg/L)的磷胺可作為念珠藻的營養(yǎng)元素刺激其生長，而濃度高于1.0 mg/L則抑制生長。王朝暉等[14]研究也表明高效氯氰菊酯農(nóng)藥在低濃度組(<1.8 mg/L)對藻細胞有刺激生長的效應(yīng)，高濃度組(≥3.2 mg/L)農(nóng)藥脅迫可能會引起藻細胞內(nèi)活性氧積累，造成膜脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜及葉綠體等細胞器，使葉綠素含量下降、代謝酶活性降低，進而加劇細胞膜損傷，出現(xiàn)離子、蛋白等外流，從而影響藻類生長繁殖，導(dǎo)致藻細胞死亡。該研究結(jié)果與王朝暉等研究結(jié)果基本一致，但略有不同。低濃度組(1.0 mg/L)藻細胞密度與對照組無明顯差別，高濃度組(>2.0 mg/L)藻細胞生長受到明顯抑制。此外，不同的藻類由于其自身的生理原因，細胞的結(jié)構(gòu)不同，毒害藻類的靶位機理不同，其對農(nóng)藥的敏感性也不同。硅藻對氯氰菊酯的敏感性相對較高，如中肋骨條藻在氯氰菊酯濃度大于50 μg/L就會產(chǎn)生明顯的抑制，而藍藻門和綠藻門對氯氰菊酯的耐受性較高，10.0～50.0 mg/L 氯氰菊酯刺激或稍抑制聚球藻的生長[15]，柵藻屬種類具有明顯的耐受性，10.0～50.0 mg/L氯氰菊酯抑制雙對柵藻的生長，而斜生柵藻的96 hEC50高達 112.0 mg/L[16]。蛋白核小球藻對氯氰菊酯的耐受性相對處于中等偏低水平。

3.3 重金屬和農(nóng)藥對蛋白核小球藻的毒性作用

自然環(huán)境中往往是2種或多種污染物同時存在，但目前關(guān)于復(fù)合污染的研究主要集中在多種重金屬的復(fù)合污染或者是多種農(nóng)藥的復(fù)合污染方面，而關(guān)于重金屬和農(nóng)藥復(fù)合污染的研究很少，尤其是對水體中復(fù)合污染的研究相對較少。黃河等[17]研究了鎘和乙草胺單一及復(fù)合污染對浮萍生長的影響，發(fā)現(xiàn)鎘和乙草胺的復(fù)合污染大于單一污染，且鎘污染大于乙草胺。胡曉娜[18]研究鎘與 S-異丙甲草胺聯(lián)合作用斜生柵藻時發(fā)現(xiàn)低濃度表現(xiàn)為協(xié)同作用，高濃度表現(xiàn)為拮抗作用。Rac-和S-異丙甲草胺與鋅的聯(lián)合毒性作用類型表現(xiàn)為除草劑在低濃度下為部分相加作用，高濃度下為拮抗作用。與單一污染相比，在復(fù)合污染下藻類的總蛋白含量、細胞膜的通透性、SOD酶水平均發(fā)生改變，因為不同重金屬離子和農(nóng)藥對藻類的污染機制不同，其復(fù)合污染影響更為復(fù)雜。該研究表明，汞和氯氰菊酯的聯(lián)合毒性是在低濃度和高濃度組水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)(AI)均小于1，表現(xiàn)為拮抗作用。因此，汞和氯氰菊酯的同時存在會降低對浮游植物的毒性。

[1] 修瑞琴，許永香，傅迎春，等.水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)法[J].環(huán)境化學(xué)，1994，13(3)：269-271.

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Combined Toxicity of Mercury and Cypermethrin toChlorellapyrenoidosa

WANG Pan-ting, LI Wei-chi, SUN Xu, MA Cheng-xue*

(Department of Wetland Science, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150000)

Using the laboratorial culture method, the separate and combined effects of different concentrations of Hg2+and various concentrations of the pesticide of cypermethrin in the acute toxic effects onChlorellapyrenoidosawere studied. The results showed that, when Hg2+combines alone with cypermethrin, the lower concentrations of Hg2+(less than 5 μg/L) and cypermethrin (less than 2 mg/L) had no significant inhibitory effect on chlorella, but as the concentration increases, the inhibition increased. AndEC50values were decreased along with time lasting. Their combined effect, with time lasting, half effect concentration (EC50) and that of pollutants alone shares the same trend,EC50-24h was 2.366 mg/L,EC50-96h was 1.711 mg/L, there is obviously time-effect relationship. According to the combined effects of aquatic toxicology and additive index method, the low concentration group and high concentration group both showed antagonistic effect, Hg2+and cypermethrin coexists, both of which reduce the growth of inhibition ofChlorellapyrenoidosa.

Chlorellapyrenoidosa; Hg2+; Cypermethrin; The combined toxicity; Antagonism effect

東北林業(yè)大學(xué)創(chuàng)新項目(201410225171)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項(2572014EA07-04)。

王攀婷(1994- )，女，陜西咸陽人，本科生，專業(yè)：野生動物與自然保護區(qū)管理(濕地科學(xué))。*通訊作者，講師，博士，從事水生生物學(xué)研究。

2015-11-09

S 481+.8

A

0517-6611(2015)35-191-03