王攀婷，厲威池，孫 旭，馬成學(xué)

(東北林業(yè)大學(xué)濕地科學(xué)系，黑龍江哈爾濱 150000)

?

汞和農(nóng)藥氯氰菊酯對(duì)蛋白核小球藻的復(fù)合污染急性毒性

王攀婷，厲威池，孫 旭，馬成學(xué)*

(東北林業(yè)大學(xué)濕地科學(xué)系，黑龍江哈爾濱 150000)

采用實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法，研究不同濃度的Hg2+和不同濃度的農(nóng)藥氯氰菊酯單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，Hg2+和氯氰菊酯單獨(dú)作用時(shí)，較低濃度的Hg2+(小于5 μg/L)和氯氰菊酯(小于2 mg/L)對(duì)小球藻無明顯抑制作用，但隨著濃度增大，抑制作用增強(qiáng)。且半效應(yīng)濃度(EC50)值均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減??；二者聯(lián)合作用時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，EC50與污染物質(zhì)單獨(dú)作用時(shí)的趨勢(shì)相同，EC50-24 h為2.366 mg/L，EC50-96 h為1.711 mg/L，存在明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。并且根據(jù)水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)法得出，低濃度和高濃度組均表現(xiàn)拮抗作用，Hg2+與氯氰菊酯的同時(shí)存在降低了兩者對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制作用。

蛋白核小球藻；Hg2+；氯氰菊酯；復(fù)合污染；拮抗作用

近年來重金屬汞和農(nóng)藥的排放越來越嚴(yán)重，嚴(yán)重污染水生態(tài)系統(tǒng)，尤其是淡水生態(tài)系統(tǒng)。浮游植物作為水域初級(jí)生產(chǎn)力在水生態(tài)系統(tǒng)中起著不可替代的作用。國內(nèi)開展了很多的相關(guān)研究，但絕大多數(shù)都是研究單一方面對(duì)浮游植物的影響，而在淡水生態(tài)系統(tǒng)中重金屬污染物和農(nóng)藥污染常常同時(shí)存在，它們的作用顯然是復(fù)合污染。重金屬和農(nóng)藥單一方面的毒性試驗(yàn)顯然不能完全客觀地反映污染物對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)中浮游植物的影響，因此，有必要研究它們的復(fù)合污染毒性效應(yīng)。

目前，關(guān)于重金屬汞和農(nóng)藥對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響有較多研究報(bào)道，但關(guān)于汞和氯氰菊酯對(duì)蛋白核小球藻的復(fù)合污染毒性效應(yīng)的研究尚未見報(bào)道。為此，筆者以蛋白核小球藻為例，研究了汞和氯氰菊酯對(duì)浮游植物的急性毒性和復(fù)合污染毒性效應(yīng)，以期為多種污染物的復(fù)合污染效應(yīng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物。蛋白核小球藻由中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫提供，采用SE藻類培養(yǎng)液配方培養(yǎng)，引種680 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值為0.20的活性藻種1 ml，培養(yǎng)溫度為(28±1)℃，光照強(qiáng)度為10 000 lux，在500 ml 錐形瓶中連續(xù)光照下培養(yǎng)8 d，至吸光度值達(dá)到0.08時(shí)開始加入汞和氯氰菊酯。

1.1.2 供試藥劑。4.5%高效氯氰菊酯為天津市匯源化學(xué)品有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗(yàn)。在處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻類培養(yǎng)液中，將氯化汞配制成Hg2+濃度為0、5、10、50、100、1 000 μg/L 6個(gè)不同濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，不充氣條件下每日搖勻3次。在處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻類培養(yǎng)液中，將4.5%高效氯氰菊酯用丙酮配制成0、1、2、3、4、5 mg/L 6個(gè)不同濃度梯度，空白組加入相同濃度丙酮。復(fù)合污染毒性試驗(yàn)在單一毒性基礎(chǔ)上按1∶1單位添加進(jìn)行6個(gè)不同濃度的梯度試驗(yàn)。

1.2.2 復(fù)合污染毒性評(píng)價(jià)。試驗(yàn)得到單一毒性和復(fù)合污染毒性的EC50后，采用修瑞琴等[1]的水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)法計(jì)算進(jìn)行評(píng)價(jià)。

S=Am/A1+Bm/B1

式中，S為對(duì)蛋白核小球藻毒性相加之和；A1、B1為單一污染物的EC50；Am、Bm為復(fù)合污染下的EC50。當(dāng)S<1時(shí)，相加指數(shù)AI=1/S-1.0；當(dāng)S> 1時(shí)，相加指數(shù)AI=S(-1)+ 1.0。最后根據(jù)AI的結(jié)果評(píng)價(jià)復(fù)合污染效應(yīng)，AI>0 為協(xié)同作用；AI<0 為拮抗作用；AI=0 為相加作用。

1.2.3 藻細(xì)胞EC50的計(jì)算。特定生長(zhǎng)率(U)由公式(1)計(jì)算，生長(zhǎng)抑制百分率(EC)定義為氯氰菊酯抑制生長(zhǎng)率的百分比，計(jì)算公式為式(2)，EC50值采用抑制百分率的概率單位-濃度對(duì)數(shù)直線回歸法進(jìn)行計(jì)算，并計(jì)算EC50的95%可信限范圍。

U=ln(Nt/N0)/t

(1)

EC=(U0-Ui)/U0×100%

(2)

式中，U為特定生長(zhǎng)率(d-1)；N0為初始細(xì)胞密度(個(gè)/ml)；Nt為培養(yǎng)t天時(shí)的細(xì)胞密度(個(gè)/ml)；U0是對(duì)照組的特定生長(zhǎng)率；Ui是試驗(yàn)組的特定生長(zhǎng)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 汞和氯氰菊酯對(duì)蛋白核小球藻的單一和復(fù)合毒性

由圖1～3可知，在不同濃度汞和氯氰菊酯的暴露下，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)受到不同程度的影響。相同時(shí)間下不同汞處理濃度組藻細(xì)胞均顯著降低，且隨著汞濃度的升高，對(duì)蛋白核小球藻的抑制更顯著。相同條件下，低濃度(1 mg/L)的氯氰菊酯組對(duì)藻細(xì)胞抑制不明顯，濃度超過2 mg/L以后隨著氯氰菊酯濃度的增加，對(duì)蛋白核小球藻的抑制更顯著。汞和氯氰菊酯復(fù)合污染下不同處理組藻細(xì)胞均顯著降低。

2.2 汞和氯氰菊酯對(duì)蛋白核小球藻的復(fù)合污染毒性(EC50)

由表1可知，汞和氯氰菊酯單獨(dú)作用時(shí)，EC50值均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減??；二者聯(lián)合時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，EC50與污染物質(zhì)單獨(dú)作用時(shí)的變化趨勢(shì)相同，24 h時(shí)的EC50值為2.366 mg/L，96 h時(shí)的EC50值為1.711 mg/L，存在明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

表1 汞和氯氰菊酯對(duì)蛋白核小球藻的復(fù)合污染毒性

2.3 水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)

由表2可知，低濃度和高濃度組均表現(xiàn)為拮抗作用，表明Hg2+與氯氰菊酯的同時(shí)存在降低了兩者對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制作用。可能是因?yàn)閮烧咴谠寮?xì)胞內(nèi)發(fā)生生理反應(yīng)，引起了藻細(xì)胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)、葉綠素等水平變化，從而表現(xiàn)拮抗作用。

表2 水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)

3 討論

3.1 重金屬汞對(duì)蛋白核小球藻的毒性作用

近年來隨著水體重金屬污染的加重，人們對(duì)其的研究也越來越多，高濃度的重金屬對(duì)藻類均有抑制作用[2]，這是因?yàn)橹亟饘匐x子造成藻細(xì)胞線粒體損傷，影響了光合作用的電子傳遞系統(tǒng)，阻礙了蛋白質(zhì)合成，從而抑制了藻類生長(zhǎng)[3-4]，5種對(duì)生物毒性最大的重金屬汞、鎘、鉻、鉛、砷中，對(duì)浮游植物影響最大的為汞。汞對(duì)浮游植物的毒害作用主要是通過與重要的生物大分子的功能基團(tuán)相結(jié)合，擾亂質(zhì)膜正常結(jié)構(gòu)，影響營養(yǎng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而破環(huán)細(xì)胞正常的生理功能。離子態(tài)汞可以直接結(jié)合琉基蛋白的-SH基團(tuán)，改變磷酸基團(tuán)與活性基團(tuán)ADP或ATP之間的反應(yīng)親和性，改變膜的透性等[5]。另一方面，汞可以促進(jìn)活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生和積累，對(duì)浮游植物造成氧化脅迫，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞膜脂、核酸及細(xì)胞色素等變性失活，加大細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，并且影響光合作用的電子傳遞系統(tǒng)，導(dǎo)致光合色素?fù)p害和葉綠素含量下降[6-8]。對(duì)于不同門類的藻類，汞對(duì)硅藻生長(zhǎng)抑制最明顯，對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)則表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的Hormesis效應(yīng)。可能是細(xì)胞壁內(nèi)的有機(jī)物(如多糖組成的膠鞘、膠被或黏液等胞外多糖)通常能絡(luò)合重金屬離子，從而使金屬離子不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[9-10]。也有研究證明，藻類細(xì)胞內(nèi)部尚有一套保護(hù)系統(tǒng)可解除有毒物質(zhì)的毒素，該解毒作用使重金屬形成有機(jī)金屬化合物沉淀下來[11]。對(duì)于綠藻門的不同種類來說，汞對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制明顯大于對(duì)柵藻的抑制，從該研究結(jié)果來看，汞對(duì)蛋白核小球藻的24 h半致死濃度(36.98 μg/L)明顯低于汞對(duì)柵藻的24 h半致死濃度(1.9 mg/L)。汞對(duì)蛋白核小球藻的EC50值表現(xiàn)為隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，存在劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

3.2 農(nóng)藥氯氰菊酯對(duì)蛋白核小球藻的毒性作用

除蟲菊酯類殺蟲劑由于其高效、低毒、廣譜、光穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林生產(chǎn)中，造成大量菊酯類農(nóng)藥經(jīng)地表徑流流入江、河、湖泊等水體，同時(shí)對(duì)生活于水體中的浮游植物產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。因水生藻類具有個(gè)體小、繁殖快、易獲得、對(duì)農(nóng)藥高度敏感等特點(diǎn)，所以農(nóng)藥對(duì)其影響較明顯。通常低濃度的農(nóng)藥可作為藻類生長(zhǎng)的營養(yǎng)源，促進(jìn)藻類生長(zhǎng)，相反，高濃度則抑制藻類生長(zhǎng)[12]。Perona等[13]發(fā)現(xiàn)低濃度(<1.0 mg/L)的磷胺可作為念珠藻的營養(yǎng)元素刺激其生長(zhǎng)，而濃度高于1.0 mg/L則抑制生長(zhǎng)。王朝暉等[14]研究也表明高效氯氰菊酯農(nóng)藥在低濃度組(<1.8 mg/L)對(duì)藻細(xì)胞有刺激生長(zhǎng)的效應(yīng)，高濃度組(≥3.2 mg/L)農(nóng)藥脅迫可能會(huì)引起藻細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，造成膜脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜及葉綠體等細(xì)胞器，使葉綠素含量下降、代謝酶活性降低，進(jìn)而加劇細(xì)胞膜損傷，出現(xiàn)離子、蛋白等外流，從而影響藻類生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。該研究結(jié)果與王朝暉等研究結(jié)果基本一致，但略有不同。低濃度組(1.0 mg/L)藻細(xì)胞密度與對(duì)照組無明顯差別，高濃度組(>2.0 mg/L)藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。此外，不同的藻類由于其自身的生理原因，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)不同，毒害藻類的靶位機(jī)理不同，其對(duì)農(nóng)藥的敏感性也不同。硅藻對(duì)氯氰菊酯的敏感性相對(duì)較高，如中肋骨條藻在氯氰菊酯濃度大于50 μg/L就會(huì)產(chǎn)生明顯的抑制，而藍(lán)藻門和綠藻門對(duì)氯氰菊酯的耐受性較高，10.0～50.0 mg/L 氯氰菊酯刺激或稍抑制聚球藻的生長(zhǎng)[15]，柵藻屬種類具有明顯的耐受性，10.0～50.0 mg/L氯氰菊酯抑制雙對(duì)柵藻的生長(zhǎng)，而斜生柵藻的96 hEC50高達(dá) 112.0 mg/L[16]。蛋白核小球藻對(duì)氯氰菊酯的耐受性相對(duì)處于中等偏低水平。

3.3 重金屬和農(nóng)藥對(duì)蛋白核小球藻的毒性作用

自然環(huán)境中往往是2種或多種污染物同時(shí)存在，但目前關(guān)于復(fù)合污染的研究主要集中在多種重金屬的復(fù)合污染或者是多種農(nóng)藥的復(fù)合污染方面，而關(guān)于重金屬和農(nóng)藥復(fù)合污染的研究很少，尤其是對(duì)水體中復(fù)合污染的研究相對(duì)較少。黃河等[17]研究了鎘和乙草胺單一及復(fù)合污染對(duì)浮萍生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)鎘和乙草胺的復(fù)合污染大于單一污染，且鎘污染大于乙草胺。胡曉娜[18]研究鎘與 S-異丙甲草胺聯(lián)合作用斜生柵藻時(shí)發(fā)現(xiàn)低濃度表現(xiàn)為協(xié)同作用，高濃度表現(xiàn)為拮抗作用。Rac-和S-異丙甲草胺與鋅的聯(lián)合毒性作用類型表現(xiàn)為除草劑在低濃度下為部分相加作用，高濃度下為拮抗作用。與單一污染相比，在復(fù)合污染下藻類的總蛋白含量、細(xì)胞膜的通透性、SOD酶水平均發(fā)生改變，因?yàn)椴煌亟饘匐x子和農(nóng)藥對(duì)藻類的污染機(jī)制不同，其復(fù)合污染影響更為復(fù)雜。該研究表明，汞和氯氰菊酯的聯(lián)合毒性是在低濃度和高濃度組水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)(AI)均小于1，表現(xiàn)為拮抗作用。因此，汞和氯氰菊酯的同時(shí)存在會(huì)降低對(duì)浮游植物的毒性。

[1] 修瑞琴，許永香，傅迎春，等.水生毒理聯(lián)合效應(yīng)相加指數(shù)法[J].環(huán)境化學(xué)，1994，13(3)：269-271.

[2] LIN K C，LEE Y L，CHEN C Y.Metal toxicity toChlorrellapyrenoidosaassessed by a short-term continuous test[J].J Hazard Mater，2007，142：236-241.

[3] 閻海，王杏君，林毅雄，等.銅、鋅和錳抑制蛋白核小球藻生長(zhǎng)的毒性效應(yīng)[J].環(huán)境科學(xué)，2001，22(1)：23-26.

[4] 楊世勇，王方，謝建春.重金屬對(duì)植物的毒害及植物的耐性機(jī)制[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，27(1)：71-74.

[5] HALL L M，TAGLOR K B，JONES D D.Expression of a foreign gene inChlamydomonasreinhardtii[J].Gene，1933，124：75-81.

[6] CHO U H，PARK J O.Mercury-induced oxidative stress in tomato seedlings [J].Plant science，2000，156(1)：1-9.

[7] ORTEGA-VILLASANTE C，RELLAN-ALVAREZ R，DEL CAMPO F F.Cellular damage induced by cadmium and mercury inMedicagosativa[J].Journal of experimental botany，2005，56(418)：2239-2251.

[8] ZHOU Z S，HUANG S Q，GUO K.Metabolic adaptations to mercury-induced oxidative stress in roots ofMedicagosativaL.[J].Journal of inorganic biochemistry，2007，101(1)：1-9.

[9] PARKERRR D L，SCHRAM B R，PLUDE J L，et al． Effect of metal cations on the viscosity of a pectin-like capsular polysaccharide from Cyanobacterium Microcystis flos-aquae C3-40[J]． Appl EnvironMicrobiol，1996，62(4)：1208-1213．

Combined Toxicity of Mercury and Cypermethrin toChlorellapyrenoidosa

WANG Pan-ting, LI Wei-chi, SUN Xu, MA Cheng-xue*

(Department of Wetland Science, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150000)

Using the laboratorial culture method, the separate and combined effects of different concentrations of Hg2+and various concentrations of the pesticide of cypermethrin in the acute toxic effects onChlorellapyrenoidosawere studied. The results showed that, when Hg2+combines alone with cypermethrin, the lower concentrations of Hg2+(less than 5 μg/L) and cypermethrin (less than 2 mg/L) had no significant inhibitory effect on chlorella, but as the concentration increases, the inhibition increased. AndEC50values were decreased along with time lasting. Their combined effect, with time lasting, half effect concentration (EC50) and that of pollutants alone shares the same trend,EC50-24h was 2.366 mg/L,EC50-96h was 1.711 mg/L, there is obviously time-effect relationship. According to the combined effects of aquatic toxicology and additive index method, the low concentration group and high concentration group both showed antagonistic effect, Hg2+and cypermethrin coexists, both of which reduce the growth of inhibition ofChlorellapyrenoidosa.

Chlorellapyrenoidosa; Hg2+; Cypermethrin; The combined toxicity; Antagonism effect

東北林業(yè)大學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目(201410225171)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2572014EA07-04)。

王攀婷(1994- )，女，陜西咸陽人，本科生，專業(yè)：野生動(dòng)物與自然保護(hù)區(qū)管理(濕地科學(xué))。*通訊作者，講師，博士，從事水生生物學(xué)研究。

2015-11-09

S 481+.8

A

0517-6611(2015)35-191-03