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        福爾馬林固定石蠟包埋樣本提取的RNA質(zhì)量分析及其臨床應(yīng)用

        2015-03-28 02:11:12薛洋曾富春舒駿叢偉
        實驗與檢驗醫(yī)學(xué) 2015年1期
        關(guān)鍵詞:基因突變試劑盒測序

        薛洋,曾富春,舒駿,叢偉

        (四川省人民醫(yī)院胸外科,四川 成都610072)

        福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,F(xiàn)FPE)組織是目前國內(nèi)外運用最為廣泛的組織保存形式。因為其能夠保持組織的特殊形態(tài),而且保存時間較長,能夠適合后期的免疫組化和組織學(xué)分析,為臨床治療的選擇提供可靠的保障。

        目前,分子靶向治療逐步成為腫瘤治療的主流,在臨床用藥前對患者基因突變狀態(tài)進行檢測,可正確指導(dǎo)臨床個體化用藥,減輕患者經(jīng)濟負擔(dān),提高分子靶向藥物治療效果。因此,從FFPE樣本中提取高質(zhì)量的DNA/RNA進行分子靶標檢測也逐漸受到關(guān)注。從FFPE中提取到能夠有效擴增的DNA/RNA不僅適用于回顧性研究,也對疾病的診斷與鑒別、評估疾病預(yù)后和探索疾病分子機制具有重要意義[1]。

        但是DNA/RNA在福爾馬林固定和石蠟包埋的過程中,都有不同程度的片段化,而且樣本大小、固定時間、固定溫度和包埋條件等等都對DNA/RNA的質(zhì)量產(chǎn)生極大的影響。近年來,研究人員試圖了解在FFPE樣本制備過程中存在著的各種對DNA/RNA的不利因素,找出解決方案,力求提取出高質(zhì)量的DNA/RNA,用于后續(xù)的基因突變分析,還原樣本真實的基因信息,以提高FFPE樣本在疾病的診斷和預(yù)后中的應(yīng)用價值。

        在2011年發(fā)表的《中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家共識》中,對FFPE樣本的處理提出了規(guī)范化操作流程,使得各大醫(yī)院能輕松地完成從FFPE樣本中提取到高質(zhì)量的DNA,用于表皮細胞生長因子受體(EGFR)的基因突變檢測,為非小細胞肺癌的靶向治療提供了重要的臨床依據(jù)。但是由于環(huán)境中存在較多且穩(wěn)定的RNA酶,導(dǎo)致從FFPE樣本中提取完整的RNA較為困難。隨著技術(shù)的不斷完善,國內(nèi)外出現(xiàn)了許多不同的提取方法,所得RNA的產(chǎn)量及擴增效率也存在著很大差異[2-4]。因此,目前存在著很多質(zhì)疑:能否從FFPE樣本中提取到高質(zhì)量并且足夠多的RNA用于后續(xù)的基因突變檢測?

        目前尚無文獻報道對國內(nèi)大隊列的FFPE樣本提取的RNA質(zhì)量進行分析。因此,本研究從國內(nèi)不同地區(qū)收集了994例FFPE樣本,采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的FFPE樣品RNA分離試劑盒(2013年獲CFDA批準上市)進行RNA分離,對RNA質(zhì)量進行分析,并將提取的RNA用于EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測,通過對比測序結(jié)果,以此判斷采用FFPE樣本RNA進行基因突變檢測的可靠性。

        1 材料與方法

        1.1 樣本來源 收集2010年1月至2013年12月共994例FFPE樣本,其中四川省人民醫(yī)院303例、上海市某醫(yī)院389例、福建省某醫(yī)院302例,所有樣本均有明確的病理診斷結(jié)果,并根據(jù)地區(qū)來源和不同年限進行分類,每例患者的組織蠟塊連續(xù)切2張5μm厚的切片。

        1.2 試劑 FFPE樣品RNA分離試劑盒 (廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司,貨號:ADx-FF04,簡稱AmoyDx RNA試劑盒);人類EML4-ALK基因融合檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司);人類ROS1基因融合檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)。

        1.2 方法

        1.2 .1 FFPE樣本的RNA分離 采用AmoyDx RNA試劑盒進行RNA抽提。(1)切片:一次性切片刀,連續(xù)5μm厚切片,每個蠟塊取2個切片,置入1個1.5ml EP管內(nèi),4℃冰箱保存;(2)脫蠟:分析純二甲苯浸沒組織切片,渦旋混勻促使組織溶解,離心棄上清;(3)脫二甲苯:加入無水乙醇以去除二甲苯,離心棄上清;(4)干燥;組織沉淀物經(jīng)干燥蒸發(fā)殘留的乙醇;(5)蛋白消化:蛋白酶K及其緩沖液浸沒組織 ,56℃消 化 15min,80℃ 孵 育 15min;(6)DNA 降解:加入DNaseⅠ及其緩沖液,吹打混勻后靜置15min;(7)RNA吸附:加入結(jié)合緩沖液,用吸附柱吸附RNA;(8)RNA收集:洗滌兩次吸附柱,空管離心14000r/min 5min; 加入 80μl RNase-freeWater,靜置3min;14000r/min離心1min。RNA樣本立即保存于-80℃冰箱中。

        1.2 .2 RNA的質(zhì)量檢測 使用Thermo Scientific公司的NanoDrop 1000超微量分光光度計檢測核酸的純度和濃度。A260的數(shù)值即OD值作為核酸濃度的指標,濃度以ng/μl為單位。A260/A280和A260/A230的比值作為核酸純度的指標。

        取5μlAmoyDx RNA試劑盒提取的RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,以鑒定RNA的完整性。取6μl RNA用于HPRT1基因檢測,用于評估RNA樣本中能進行有效擴增的片段含量。

        1.2 .3 qRT-PCR 將所提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。采用Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。25μl逆轉(zhuǎn)錄體系包含:6μl RNA,5.0μl 5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液,1μl M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl),3.5 pmol/l特異性逆轉(zhuǎn)錄引物。反應(yīng)程序為:42℃60min;95℃5min。分別取5μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行HPRT1基因、EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測。40μl反應(yīng)體系含有5μl cDNA,0.2mmol/L dNTPs,引物濃度為 0.4μmol/L,1 U ExTaq DNA聚合酶(Takara公司),4.0μl10×PCR 緩沖液。反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性 5min,15個循環(huán)的 95℃變性 25s,64℃退火 20s,72℃延伸20s,接著31個循環(huán)的 93℃變性 25s,60℃退火 35s(收集 FAM 和 HEX信號),72℃延伸20s。實時熒光定量PCR儀機型為Stratagene Mx3000PTM。

        1.2 .4 Sanger測序 所提取的RNA樣本先進行逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR,然后將得到的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

        對于EML4-ALK基因融合陽性和ROS1基因融合陽性的RNA樣本,根據(jù)已有報道的基因融合序列設(shè)計引物進行擴增;對于EML4-ALK基因融合陰性和ROS1基因融合陰性的RNA樣本,則根據(jù)EML4-ALK基因和ROS1基因斷裂點處的序列設(shè)計引物進行擴增。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 將所提RNA進行EML4-ALK和ROS1基因融合檢測,同時使用Sanger測序法進行驗證,采用χ2檢驗分析其一致性。采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 RNA純度 對本實驗所得的RNA純度進行檢測:A260/A280(圖 1)和 A260/A230(圖 2),RNA 的A260/A280和A260/A230均值分別為1.97和1.92。

        圖1 RNA A260/A280

        圖2 RNA A260/A230

        2.2 RNA濃度 對本實驗所得的RNA濃度進行檢測。RNA的濃度和HPRT1的qRT-PCR檢測的Ct均值分別為 204.23ng/μl(圖 3)和 14.09(圖 4)。

        圖3 RNA濃度

        圖4 RNA HPRT1 Ct值

        2.3 RNA完整性 對本實驗所得的RNA的完整性進行檢測。FFPE樣本的RNA電泳多數(shù)呈寬帶狀、彌散分布的smear帶,提示降解明顯,平均長度集中在200bp左右。

        2.3 .1 比較不同地區(qū)來源的FFPE樣本提取的RNA質(zhì)量 分別對各家醫(yī)院的樣本RNA質(zhì)量進行評估(圖5)。結(jié)果顯示:四川省人民醫(yī)院樣本RNA的 A260/A280、A260/A230、濃度和 HPRT1 的 Ct均值分別為 2.02、1.98、196ng/μl和 12.0。 上海市某醫(yī)院的FFPE樣本RNA的A260/A280和A260/A230均值分別為1.94和1.84, 平均濃度為248ng/μl, 經(jīng)qRT-PCR檢測的HPRT1的Ct值為14.8,其中有兩例標本沒有檢測到HPRT1的Ct值,標本檢測失敗。福建省某 醫(yī) 院 樣 本 RNA的 A260/A280、A260/A230、 濃 度 和HPRT1 的 Ct 均 值 分 別 為 1.96、1.98、156ng/μl、15.3。

        圖5 不同地區(qū)來源的FFPE樣本的RNA質(zhì)量比較

        2.3 .2比較不同保存年限的FFPE樣本的RNA質(zhì)量 收集2010~2013年四川省人民醫(yī)院的FFPE樣本,其中2010年23例,2011年75例,2012年110例,2013年95例。對上述FFPE樣本進行RNA抽提,并對所獲得RNA的質(zhì)量進行檢測(圖6)。

        2010 年的FFPE樣本提取的RNA的A260/A280、A260/A230、濃度和 HPRT1的 Ct均值分別為1.97、2.03、146 ng/μl、12.8;2011 年的 FFPE 樣本提取的RNA 的 A260/A280、A260/A230、 濃度和 HPRT1的 Ct值分別為 2.02、2.01、169ng/μl、12.6;2012 年的 FFPE樣 本 提 取 的 RNA的 A260/A280、A260/A230、 濃 度 和HPRT1 的 Ct 均 值 分 別 為 2.03、1.98、226ng/μl、12.4;2013年的 FFPE樣本提取的 RNA的 A260/A280、A260/A230、 濃度和 HPRT1的 Ct均值分別為2.04、1.94、195ng/μl、10.9。

        圖6 不同保存年限的FFPE樣本的RNA質(zhì)量比較

        2.4 EML4-ALK和ROS1基因融合檢測與Sanger測序結(jié)果的對比 人類EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測試劑盒與Sanger測序法均得到檢測結(jié)果的FFPE樣本為992例,檢測成功率為99.80%(992/994)。兩種方法檢測結(jié)果均為EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合陽性的樣本數(shù)為117例,總檢出率為11.79%(117/992)。兩種方法檢測結(jié)果均為EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合陰性的樣本數(shù)為875例(表1)。

        表1 試劑盒法和Sanger測序法對臨床樣本的檢測結(jié)果對比情況

        根據(jù)表1所列檢測數(shù)據(jù),兩種方法對992例臨床FFPE樣本的檢測結(jié)果的符合率為:

        ①兩種方法檢測的基因融合陽性符合率為a/(a+c)=100%。

        ②兩種方法檢測的基因融合陰性符合率為d/(b+d)=100%。

        ③兩種檢測方法檢測結(jié)果的總符合率為 (a+d)/(a+b+c+d)=100%。

        即使用人類EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合檢測試劑盒的檢測結(jié)果與Sanger測序法完全一致。

        3 討論

        FFPE樣本具有來源充足、疾病種類廣闊、疾病信息豐富和監(jiān)控腫瘤性疾病的長期臨床處理過程以及可長期保存、原位診斷和隨時獲取等[5]諸多優(yōu)點,顯示了其在疾病研究中的巨大潛力。因此,從FFPE中獲取高質(zhì)量的RNA,對疾病尤其是腫瘤的研究和臨床用藥治療[6-8]具有重要的意義。

        RNA樣本的質(zhì)量檢測一般分為總量、純度與完整性三大項。其中總量可以通過微量分光光度計測定260nm吸收值進行計算。純度可以通過微量分光光度計測定A260/A230的比值,用于評估有機溶劑殘留,理想值應(yīng)當≥1.8,如果比值低于1.8,則表明存在有機物/鹽離子等污染;測定A260/A280吸收值的比值可用于評估蛋白質(zhì)污染比例,理想值應(yīng)為1.9-2.1,如果比值低于1.8,則表明存在蛋白污染。完整性可以通過電泳,目測有無基因組DNA污染,有無RNA降解(28S,18S條帶)[9]。研究表明,每個樣本的Ct值與該樣本的特定基因的起始拷貝數(shù)存在一定關(guān)系[10],起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。因此,只要比較不同樣本的Ct值,即可推斷出樣本中含有特定基因的起始拷貝數(shù)的多寡。由于HPRT1是一種管家基因,在不同來源的細胞中的表達比較穩(wěn)定,因此可以通過比較RNA樣本中HPRT1的qRT-PCR的Ct值,來判斷樣本中的可擴增片段的濃度?;谏鲜鲋笜?,本文總共對994例FFPE樣本采用AmoyDx RNA試劑盒進行RNA抽提 ,RNA 的 質(zhì) 量 通 過 A260/A280、A260/A230、 濃 度 和HPRT1的qRT-PCR的Ct值來檢測。

        各家醫(yī)院對于樣本的處理有所不同,包括樣本離體時間、固定時間和溫度、包埋時間和溫度、FFPE組織保存時間和溫度等。而上述條件均會導(dǎo)致FFPE樣本中RNA的片段化程度不同。本文從三個不同地區(qū)的三家醫(yī)院收集FFPE樣本,均采用AmoyDx RNA試劑盒提取RNA,并對RNA的質(zhì)量進行檢測分析。從上述結(jié)果可以看出:所提取的RNA的A260/A280和A260/A230數(shù)值均大于1.8,說明該RNA試劑盒能去除多余的蛋白質(zhì)和鹽離子,獲得的RNA純度較好。在后續(xù)的qRT-PCR反應(yīng)中,三家醫(yī)院的RNA樣本都能進行有效擴增,尤其是四川省人民醫(yī)院的RNA樣本的有效擴增片段顯著多于其它兩家醫(yī)院,說明采用RNA試劑盒法從這三家醫(yī)院的FFPE樣本提取的RNA,在純度和總得率上均能適用于qRT-PCR的基因突變檢測。

        Nam等人[11]評估了樣本的儲存時間對RNA抽提質(zhì)量的影響。將FFPE樣本儲存在室溫1個月至10年。結(jié)果顯示儲存時間越長,RNA得率越低,純度也顯著降低。儲存3~8年的樣本中有58.3%能檢測出β-actin的表達,儲存1個月至1年的樣本有62.5%能檢測出β-actin的表達,儲存時間少于1個月的樣本全部能檢測出β-actin的表達。本研究對樣本的保存年限進行分組,考察RNA試劑盒提取的RNA的質(zhì)量。結(jié)果顯示,不同保存年限的FFPE樣本,所提取的RNA的純度均能符合要求,即A260/A280和A260/A230大于1.8,而在RNA得率方面,2012和2013年的FFPE樣本的RNA濃度高于2010和2011年,而且有效片段濃度也高于后者,說明FFPE樣本保存年限越長,RNA降解程度越大。

        EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合各自分別代表了一類具有特定臨床與病理特征的NSCLC分子亞群。文獻報道約3%~7%的NSCLC存在EML4-ALK基因融合[12-15],另有約1%-3%的NSCLC存在ROS1基因融合[16,17],從而為肺癌的治療提供了新的分子靶點。現(xiàn)有臨床研究表明,以EML4-ALK基因融合、ROS1基因融合為靶點的新型EML4-ALK/ROS1酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼對攜帶EML4-ALK基因融合或ROS1基因融合的NSCLC患者療效顯著,其客觀緩解率(ORR)分別為57%和54%,疾病控制率(DCR)則分別達到了87%和85%[18,19]。因此,準確檢測EML4-ALK基因融合和ROS1基因融合存在狀態(tài),可為腫瘤患者的靶向用藥治療提供必要依據(jù)。本研究檢測的EML4-ALK和ROS1融合基因陽性率為11.77%,與上述報道數(shù)據(jù)一致,而且檢測結(jié)果與Sanger測序法的陽性檢出率、陰性檢出率均為100%,說明從FFPE樣本中提取的RNA,可以用于基因突變檢測,而且檢測結(jié)果真實可靠,可為靶向治療方案的選擇提供重要的證據(jù)。

        994 例FFPE樣本RNA中有992例可用于qRT-PCR的檢測,檢測成功率為99.80%。由于目前各大醫(yī)院對樣本的處理進行了規(guī)范化操作:控制離體時間,用中性的10%福爾馬林浸泡,根據(jù)樣本大小不同來調(diào)節(jié)固定時間,使得從FFPE樣本中提取出來的RNA質(zhì)量較好,而且qRT-PCR產(chǎn)物長度較短,低于130bp,這些改善措施大大提高了從FFPE樣本中提取的RNA質(zhì)量,適合后續(xù)的基因突變檢測,使得FFPE樣本的臨床利用率大為提高,能提供真實可靠的基因突變圖譜,可為靶向治療提供可靠的保障。

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