林迪，孫長貴

(解放軍第117醫(yī)院檢驗科南京軍區(qū)醫(yī)學檢驗質(zhì)控中心，浙江 杭州310013)

諾如病毒(Norovirus，NV)是世界范圍內(nèi)引起人類非細菌性急性胃腸炎的一種高度傳染性病原菌[1]，該病毒具有高度感染性,傳播途徑廣泛,人群普遍易感,容易在餐館、學校、社區(qū)、醫(yī)院、托兒所、養(yǎng)老院等聚集性場所引起集體暴發(fā)[2]。在美國，據(jù)估計諾如病毒每年將造成2100萬人感染，71000人住院治療，800人死亡[3]。諾如病毒原型株諾瓦克病毒(Norwalk virus)于1968年在美國諾瓦克市暴發(fā)的一次急性腹瀉患者糞便中分離到，1972年Kapikian等人通過免疫電子顯微鏡從患者的糞便中檢測到直徑為27 nm的病毒顆粒，命名為諾瓦克病毒[4]。2002年8月第八屆國際病毒命名委員會批準名稱為諾如病毒。1995年，中國報道了首例諾如病毒感染，之后山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州、浙江嘉興等地區(qū)先后發(fā)生多起諾如病毒感染性腹瀉暴發(fā)疫情。本文就諾如病毒相關的結構和生物學特性、發(fā)病機制、流行病學、臨床表現(xiàn)、診斷與鑒別診斷和實驗室檢查等作簡要綜述。

1 諾如病毒的結構和生物學特性

諾如病毒屬于人杯狀病毒科、諾如病毒屬，其病毒顆粒直徑約為26～35nm，無包膜，表面粗糙，球形，呈二十面體對稱；負染色電鏡照片顯示，NV具有典型的羽狀外緣，表面有凹痕的小圓狀結構。NV為單股正鏈 RNA病毒,全長約7642bp，包括3個開放閱讀框：ORF1編碼包括保守的具有RNA多聚酶在內(nèi)的非結構蛋白；ORF2編碼分子量約為56KDa的衣殼蛋白；ORF3編碼一種分子量約為22.5KDa的強堿性微小結構蛋白[5]。目前NV尚未能按血清學進行分類，但根據(jù)RNA多聚酶區(qū)核苷酸序列的相似性，被分為5個基因組：GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ和GⅤ，其中可感染人類有GⅠ、GⅡ和GⅣ[6]，而 GⅢ、GⅡ、GⅤ分別感染牛、豬和鼠。目前，GⅡ是世界范圍內(nèi)NV流行的主要基因型，優(yōu)勢株為GⅡ-4[7]。NV對熱、乙醚和酸穩(wěn)定，室溫pH2.7環(huán)境下存活 3h，20%乙醚 4℃處理存活 18h，60℃孵育30min仍有感染性，也耐受普通飲水中3.75～6.25mg/L 的 Cl-濃度(游離氯 0.5~1.0mg/L)，但在處理污水的10mg/L的Cl-濃度中被滅活。

2 發(fā)病機制

由于NV不能在體外進行細胞培養(yǎng)，也沒有合適的動物模型，因此其發(fā)病機制的研究受到阻礙[8]。但目前大部分研究證明人組織血型抗原(histoblood group antigens，HBGAs)為 NV 與胃腸道黏膜上皮細胞結合的受體，宿主的遺傳因素被認為是NV感染的重要因素[9]。NV通過人組織血型抗原受體與胃十二指腸上皮細胞結合后，將其遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至上皮細胞內(nèi)，在其中復制產(chǎn)生新的病毒，然后再感染十二指腸和空腸上段，并造成上皮細胞空泡變性和微絨毛變短，腸上皮細胞損傷造成一系列生物大分子的數(shù)量和活性發(fā)生改變，引起糖類和脂類吸收障礙，導致腸腔滲透壓升高，體液進入腸腔，出現(xiàn)嘔吐和腹瀉。

3 流行病學

NV流行地區(qū)極為廣泛，分布于各大洲，NV感染疫情全年均可發(fā)生，但在寒冷季節(jié)呈現(xiàn)高峰，NV感染多以集體暴發(fā)流行的形式出現(xiàn)。NV感染濃度低(100個病毒顆粒即可導致發(fā)病)、環(huán)境穩(wěn)定性以及缺乏持久的免疫力等原因，導致NV感染性強[10,11]，Cannon等報道，發(fā)達國家42%~90%的非細菌性腹瀉暴發(fā)是由NV引起的[12]。我國自1995年報道了首例NV感染，之后許多地區(qū)發(fā)生NV感染疫情。2006年2月廣西大新縣農(nóng)場72人出現(xiàn)NV感染引起的急性胃腸炎癥狀；2010年12月廣州從化發(fā)生水污染引起的NV感染事件，共有429人發(fā)病；2013年3月，廣州大學城多所高校出現(xiàn)因感染NV，而導致的聚集性腹瀉病例，累計確診200多例；2013年4月，廣東省揭陽市揭陽職業(yè)技術學院近400名學生感染NV；2014年2月嘉興市多個學校和幼兒園暴發(fā)NV感染，累計報告發(fā)病人數(shù)共511人；2014年11月廣州南洋理工職業(yè)學院暴發(fā)NV感染，受感染人數(shù)達274例。由此可見，我國NV感染主要集中在南方城市，廣東、浙江、廣西等均是多發(fā)省份，且暴發(fā)起數(shù)和病例數(shù)均呈逐年增加趨勢。

3.1 傳染源和宿主范圍 傳染源主要為NV胃腸炎患者、隱性感染者及病原攜帶者。以前人被認為是NV的唯一宿主，但近年來豬、牛、鼠等動物的糞便中也檢測到該病毒。同時也有很多關于貝類引起NV暴發(fā)的報道，但實際上它們并不是宿主，只是寄生。

3.2 傳播途徑 糞-口途徑是NV感染的主要傳播方式，可以通過污染的水源、食物、物品、空氣等傳播，也可通過吸入懸浮在空中的由污染物形成的氣溶膠等形式傳播。

3.3 高危人群 NV傳染性強，每個年齡段的人均易感，但以學齡兒童和成年人為主[13]。

4 臨床表現(xiàn)和病理特點

臨床NV感染潛伏期多在24～48h，最短12h，最長72h。感染者發(fā)病突然，主要癥狀為惡心、嘔吐、腹痛、肌痛和非血性腹瀉[4]。兒童患者嘔吐普遍，成人患者腹瀉為多，24h內(nèi)腹瀉4~8次，糞便為稀水便或水樣便，無黏液膿血，糞檢白細胞陰性,未見RBC。原發(fā)感染患者的嘔吐癥狀明顯多于繼發(fā)感染者，有些感染者僅表現(xiàn)出嘔吐癥狀，故在臨床常稱為“冬季嘔吐病”。此外，頭痛、輕度發(fā)熱、寒顫也是常見癥狀，嚴重者出現(xiàn)脫水癥狀。

細胞水平的病變?yōu)槟c上皮細胞微絨毛變短、隱窩增大和細胞內(nèi)空泡形成；組織水平的病變表現(xiàn)為固有層單核細胞浸潤；沒有觀察到腸上皮細胞壞死和腸黏膜下炎性細胞浸潤。

5 診斷與鑒別診斷

5.1 診斷 主要依據(jù)流行季節(jié)、地區(qū)、發(fā)病年齡等流行病學資料、臨床表現(xiàn)以及實驗室常規(guī)檢測結果進行診斷。

5.1 .1診斷標準

5.1 .1.1疑似病例 (1)潛伏期 24~48h;(2)50%以上發(fā)生嘔吐;(3)病程 12~60 h;(4)糞便、血常規(guī)檢查無特殊發(fā)現(xiàn);(5)排除常見細菌、寄生蟲及其他病原感染。

5.1 .1.2確診病例 疑似病例基礎上，在糞便標本或嘔吐物中檢測出諾如病毒。

5.2 鑒別診斷 諾如病毒性胃腸炎與細菌性、真菌性和原蟲性腹瀉鑒別；與其他病毒性胃腸炎的鑒別。常見的病毒性胃腸炎中，輪狀病毒、腺病毒和星狀病毒性胃腸炎主要見于嬰幼兒，病程較長，多為1周左右。

6 實驗室檢測

6.1 電鏡檢查

6.1 .1直接電鏡法 (EM)將糞便標本制成懸液離心，負染病毒顆粒后直接鏡下觀察，根據(jù)病毒粒子的大小、形狀等鑒定是否為NV。但該方法靈敏度較低，要求每毫升標本中至少有105~106個病毒顆粒，患者早期病毒大量排出時的檢出率只有 10%~20%，不適合大規(guī)模流行病學調(diào)查。

6.1 .2免疫電鏡法 (IEM)將糞便標本制成懸液離心得到的病毒顆粒與標準血清共孵育，再經(jīng)負染后在鏡下觀察來檢測病毒，可用于患者恢復期血清捕捉同型抗原，該方法檢出率比直接電鏡法高10~100倍?？偟膩碚f，電鏡設備昂貴，檢出率較低，且受操作者的影響較大，不適合廣泛普及。

6.2 免疫法 目前較常用的免疫學方法包括放射免疫法(RIA)、生物素-親和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassay)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。RIA既具有免疫反應的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度,該方法可檢測抗體升高水平，但其耗時長且需放射性同位素標記；為了簡化方法，美國疾病預防控制中心建立了生物素-親和素免疫法，其靈敏度與RIA法相當，目前該方法已成為美國疾病預防控制中心檢測諾瓦克樣病毒(NLV)抗原和抗體的標準實驗方法之一；ELISA主要用于檢測NV核衣殼抗原，該方法操作簡單，價格低廉，可用于NV大規(guī)模暴發(fā)后的篩查，但對于ELISA技術來說其特異性較強在90.91%~96.37%之間，而靈敏度差異較大在43.81%~97.14%之間[14-16]。

6.3 基因芯片 該方法通過在玻璃芯片上以鏈霉親和素包被的磁珠作為標記物，采用生物素標記的核酸為樣品，通過鏈霉親和素與生物素的親和作用，進行核酸雜交檢測，雜交結果以肉眼或通過普通顯微鏡觀測，該方法靈敏度、特異性與RTPCR基本相近，但檢測費用較昂貴。

6.4 病毒核酸檢測 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應 (RTPCR)能更準確、靈敏地檢測標本中的NV，尤其是低濃度感染 (即可檢測糞便中102~104病毒顆粒/ml)，現(xiàn)已廣泛用于NV的檢測。利用RT-PCR可以快速擴增患者嘔吐物、糞便以及水中NV特異性的基因片段，成為NV診斷的金標準。GⅠ、GⅡ型諾如病毒RT-PCR檢測引物序列見表1。RT-PCR反應總體積為 25μl：PrimeScript1Step EnzymeMix,1μl；2×1 Step Buffer,12.5μl；G1SKF/G1SKR(33μmol/L)、C0G2F/G2SKR(33μmol/L)各 0.2μl；RNA，10.7μl；DEPC 水補足體系到 25μl。 擴增條件：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃30s，72℃1min，共35個循環(huán)；最后 72℃延伸 7min。

表1 RT-PCR檢測諾如病毒引物序列[6,17]

7 結束語

在我國，諾如病毒暴發(fā)平均每起暴發(fā)發(fā)病89人，暴發(fā)規(guī)模及危害性均較大[18]。近期，廣東省多處學校已陸續(xù)發(fā)生由諾如病毒感染引起的聚集性疫情，一時間“諾如”成了“登革熱”后廣州的又一流行詞。雖然屬于自限性疾病的諾如病毒性胃腸炎癥狀輕微，但其發(fā)病急、傳播速度快、涉及范圍廣，可導致嚴重的公共衛(wèi)生問題。目前尚無針對性的抗病毒藥物,以對癥或支持治療為主，一般不需使用抗生素,預后良好。由于諾如病毒只寄生于活的宿主細胞內(nèi)，無法在體外培養(yǎng)，從而不能通過傳統(tǒng)的減毒或滅活病毒方式來制備疫苗，因此迄今尚無諾如病毒疫苗問世。眼下，我國已經(jīng)到了諾如病毒的高發(fā)季節(jié)，我們應加強諾如病毒感染疫情的防控工作以及提高實驗室檢測能力，以減少諾如病毒感染疫情的暴發(fā)。

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