高玲++鄭輝

[摘要] 目的 研究TNFα可否通過神經(jīng)鈣調(diào)蛋白導(dǎo)致皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷。 方法 選取2014年3—2014年8月該研究醫(yī)室的實(shí)驗(yàn)大鼠48例為研究對象，通過對原代培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞毒性的研究可以發(fā)現(xiàn)，MTT法和LDH釋放率測定顯示大劑量的促炎性細(xì)胞因子TNFα對皮質(zhì)神經(jīng)元具有損傷作用，CsA可明顯降低TNFα引起的LDH釋放率的增加。 結(jié)果 神經(jīng)鈣調(diào)蛋白途徑在TNFα引起皮質(zhì)神經(jīng)元損傷并不起主要作用，同時(shí)TNFα可通過非神經(jīng)鈣調(diào)蛋白途徑引起神經(jīng)元損傷。 結(jié)論 通過對原代培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞毒性的研究可以發(fā)現(xiàn)，MTT法和LDH釋放率測定顯示大劑量的促炎性細(xì)胞因子TNFα對皮質(zhì)神經(jīng)元具有損傷作用，CsA可明顯降低TNFα引起的LDH釋放率的增加，而TNFα單獨(dú)作用不能明顯降低LDH的釋放率（P>0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

[關(guān)鍵詞] TNFα；神經(jīng)鈣調(diào)蛋白；介導(dǎo)；皮層神經(jīng)元；MTT法

[中圖分類號(hào)] R [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）12（c）-0102-02

神經(jīng)鈣調(diào)蛋白（calcineurin，CN）有時(shí)也被稱作鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族中的一類，也是現(xiàn)階段所知的唯一一類活性受Ca2 /CaM調(diào)節(jié)的蛋白磷酸酶。CN是由催化亞單位CnA和調(diào)節(jié)亞單位CnB組成的異二聚體。當(dāng)胞漿內(nèi)鈣增高時(shí)，可激活CN，發(fā)揮蛋白脫磷酸化作用。眾所周知，炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNFa等參與多種神經(jīng)疾?。ㄈ缰酗L(fēng)、神經(jīng)變性病等）的神經(jīng)元損傷發(fā)病機(jī)制[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)：CN介導(dǎo)了IL-1β引起的皮層神經(jīng)元損傷[2]。同為重要的細(xì)胞因子TNFα是否也是通過類似的機(jī)制引起皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷的，目前還一直未知。因此，該研究選取2014年3—2014年8月該研究醫(yī)室的實(shí)驗(yàn)大鼠48例為研究對象，擬觀察TNFα對原代培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞毒性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 試劑和藥品

凋亡檢測試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒、胎牛血清及馬血清、多聚賴氨酸、環(huán)孢菌素A（CsA）、Annexin V —FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）、TNFα、DMEM。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 對Matsushita[3]等人的研究方法稍作改變，即取孕17～19 d的SD大鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部）胎鼠，在無菌條件下將大腦皮層取出，去除軟腦膜和血管，再將其剪碎為0.5 mm3左右，采用D-Hanks液清洗2次，再放置在0.25%的胰蛋白酶中進(jìn)行消化，使溫度維持在37 ℃進(jìn)行孵育15 min左右，加入10%的胎牛血清，終止處理胰酶消化，離心后取上清。另外，加入10%的胎牛血清和5%的馬血清兩種接種培養(yǎng)液，用吸管進(jìn)行吹打，把細(xì)胞分散開，從而形成單細(xì)胞懸液，用尼龍網(wǎng)過濾懸液并計(jì)數(shù)，使細(xì)胞的濃度為1×106 cells/mL，并在具有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板上進(jìn)行接種，等待48 h后給予全量換液處理，72 h后把10 μg/mL的阿糖胞苷加入到培養(yǎng)液，促進(jìn)抑制非神經(jīng)元增生。再等待24 h后進(jìn)行半量換液。以后3 d/次的進(jìn)行半量換液，培養(yǎng)7～10 d后的神經(jīng)細(xì)胞可以用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 神經(jīng)細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn) 采用已經(jīng)培養(yǎng)好的神經(jīng)細(xì)胞，將8孔分為1組，TNFα實(shí)驗(yàn)共分6組，TNFα濃度分別為0 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL；作量效關(guān)系曲線圖，并取適當(dāng)濃度的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 測定細(xì)胞生存力 采用MTT比色法對細(xì)胞生存力進(jìn)行檢測，具體方法如下：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至所需天數(shù)時(shí)，通過TNFα等處理后的細(xì)胞，把20 μL（5 mg/mL）的MTT液加入到每個(gè)孔中，孵箱溫度維持在37 ℃左右，孵育4 h后取出，把培養(yǎng)液取出，另外加入150 μL的DMSO到每個(gè)孔中，通過微量混勻器將液體混合均勻，采用酶標(biāo)儀570 nm讀取吸光度（A）值。

1.2.4 測定乳酸脫氫酶（LDH）釋放率 采用乳酸脫氫酶試劑盒進(jìn)行LDH釋放率的測定。閱讀說明書之后仔細(xì)進(jìn)行操作，細(xì)胞的受損程度可以通過LDH釋放情況顯示，將每組8孔的培養(yǎng)細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。

1.2.5 采用免疫熒光分析細(xì)胞的壞死和凋亡 采用AnnexinV免疫熒光仔細(xì)觀察細(xì)胞的凋亡情況，凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，用PI免疫熒光觀察細(xì)胞的壞死情況，壞死的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。Annexin V免疫熒光可以在細(xì)胞凋亡過程中對翻轉(zhuǎn)至膜外的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，I S）進(jìn)行高親和力的特異性結(jié)合。熒光探針為標(biāo)記有FITC的AnnexinV，通過熒光顯微鏡仔細(xì)檢測發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目。作為一種核酸染料的PI，其本身可以透過凋亡晚期或已死亡的細(xì)胞的細(xì)胞膜，把細(xì)胞核染成紅色。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

把所得數(shù)據(jù)通過SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，用（x±s）表示計(jì)量資料，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TNFα對于培養(yǎng)大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元生長的影響

通過MTT法篩選出細(xì)胞因子TNFα對皮質(zhì)神經(jīng)元的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。從圖1a中可以看出，隨TNFα劑量的增加，皮質(zhì)神經(jīng)元吸光度值下降，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。濃度為0.1 ng/mL時(shí)，皮質(zhì)神經(jīng)元的吸光度值與正常對照組比較有明顯的下降（P<0.05）。因此選用此劑量的TNFα作用于皮質(zhì)神經(jīng)元，觀察其作用皮質(zhì)神經(jīng)元不同點(diǎn)的吸光度值變化用以反應(yīng)細(xì)胞的生存力變化。從圖1b中可見 ，TNFα（0.1 ng/mL）作用于皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞后，隨作用時(shí)間的延長，皮質(zhì)神經(jīng)元的吸光度值開始下降，在30 min之后，皮質(zhì)神經(jīng)元的吸光度值與未處理時(shí)的吸光度值比較開始明顯下降（P<0.05），呈現(xiàn)明顯的時(shí)效關(guān)系。endprint

圖1a TNFα對皮質(zhì)神經(jīng)元作用的量效關(guān)系。 圖1b TNFα對皮質(zhì)神經(jīng)元作用的時(shí)效關(guān)系。

*P<0.05， **P<0.01 vs control *P<0.05 vs control

2.2 神經(jīng)鈣調(diào)蛋白對TNFα引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響

如圖2a的MTT法中可以看出，TNFα與正常對照組比較，可明顯引起皮層神經(jīng)元的損傷（P<0.05）。而TNFα與CsA聯(lián)合應(yīng)用組，皮層神經(jīng)元的生存力提高不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在圖2b的LDH釋放率測定實(shí)驗(yàn)中可見，CsA可明顯降低TNFα引起的LDH釋放率的增加。TNFα和CsA聯(lián)合作用組，與TNFα單獨(dú)作用組一樣，不能明顯降低LDH的釋放率（P>0.05）。

圖2a MTT法觀察神經(jīng)鈣調(diào)蛋白對TNFα引起皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的影響。

圖2b LDH釋放率實(shí)驗(yàn)觀察神經(jīng)鈣調(diào)蛋白對TNFα引起皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的影響。

***P<0.001 vs control。

2.3 TNFα誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷性質(zhì)及程度研究

利用PI和Annexin V 染色標(biāo)記早期凋亡及壞死的細(xì)胞數(shù)目，從形態(tài)學(xué)的角度進(jìn)一步證明神經(jīng)鈣調(diào)蛋白對細(xì)胞因子引起的損傷作用的影響。

從圖3 TNFα（0.1 ng/mL）處理后， 細(xì)胞的凋亡和壞死率明顯增加。CsA與TNFα聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞，凋亡和壞死率與單純損傷組比較無明顯降低（P>0.05）

圖3 TNFα誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的免疫熒光

3 討論

細(xì)胞因子的神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護(hù)作用與促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的平衡密切相關(guān)。在神經(jīng)系統(tǒng)病變過程中，促炎性細(xì)胞因子變化較早，往往在神經(jīng)元發(fā)生明顯損傷（壞死）前即發(fā)生顯著變化。在神經(jīng)退行性病變過程中，腦內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生均增加。如腦AD[1] 缺血[4]。這些炎癥因子反應(yīng)可能是去除致病因素的起始者和抑制神經(jīng)退行性變過程。然而，一個(gè)失控的炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)這個(gè)過程。促炎性細(xì)胞因子如IL-1β或TNFα具有神經(jīng)毒性的研究資料很多，但詳細(xì)機(jī)制尚未闡明[3]。大量研究資料表明，IL-1β、TNFα對正常神經(jīng)元和健康組織沒有毒性作用，但在創(chuàng)傷，缺血，炎癥性腦損傷時(shí)即使處于非常低的濃度也能加重上述損傷[5]。

CN在腦組織中的含量最為豐富，尤其是在腦皮層，海馬，紋狀體中[6]。CN在腦內(nèi)有多種作用如淀粉β肽形成、凋亡、DARPP-32的去磷酸化、NOS的去磷酸化、基因調(diào)節(jié)、激素控制、缺血、長時(shí)程增強(qiáng)、記憶、突起形成、離子通道的調(diào)節(jié)等。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)CN的激活對生長有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）是強(qiáng)效的免疫抑制劑，多應(yīng)用于器官移植。在淋巴細(xì)胞中CsA通過影響T細(xì)胞增殖的有關(guān)的鈣依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而防止淋巴因子基因的激活[7]。它同時(shí)也是CN的特異性抑制劑。

該實(shí)驗(yàn)利用促炎性細(xì)胞因子TNFα損傷原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元，復(fù)制神經(jīng)退變的細(xì)胞模型。根據(jù)TNFα的量效與時(shí)效作用曲線，在皮層神經(jīng)元中分別采用 TNFα（0.1 ng/mL）的劑量損傷皮質(zhì)神經(jīng)元[8]。通過MTT法和LDH釋放率測定實(shí)驗(yàn)，可以看出，大劑量的促炎性細(xì)胞因子TNFα對皮質(zhì)神經(jīng)元具有損傷作用，CsA可明顯降低TNFα引起的LDH釋放率的增加。TNFα和CsA聯(lián)合作用組，與TNFα單獨(dú)作用組不能可明顯降低LDH的釋放率（P>0.05）。此現(xiàn)象在免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果中進(jìn)一步得到證實(shí)，CsA與TNFα聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞，凋亡和壞死率與單純損傷組比較無明顯降低（P>0.05）。因此，通過該實(shí)驗(yàn)，我們首次發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)鈣調(diào)蛋白途徑在TNFα引起皮質(zhì)神經(jīng)元損傷并不起主要作用。說明TNFα可通過非神經(jīng)鈣調(diào)蛋白途徑引起神經(jīng)元損傷。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Griffin WS， Stanley LC， Ling C， et al. Brain interleukin 1 and S-100 immunoreactivity are elevated in Down syndrome and Alzheimer disease[J].Proc Natl Acad Sci USA，1989，86（19）：7611-7615.

[2] 高玲，康勁松，候忠赤，等.神經(jīng)鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)IL-1β誘導(dǎo)的NF-kBp65的表達(dá)及神經(jīng)毒性[J].中國病理生理雜志，2005，21（4）：625-629.

[3] Wu HY， Tomizawa K， Oda Y， et al. Critical Role of calpain-mediated Cleavage of Calcineurin in Excitotoxic Neurodegeneration. J Biol Chem，2004，279（6）：4929-4940.

[4] Feuerstein GZ， Wang X， Barone， FC.The role of cytokines in the neuropathology of stroke and neurotrauma[J].Neuroimmunomodulation，1998，5（3-4）：143-159.

[5] Rothwell NJ. Sixteenth Gaddum memorial lecture December 1996. Neuroimmune interactions： the role of cytokines[J].Br J Pharmacol，1997，121（5）：841-847..

[6] Asai A， Qiu J， Narita Y， et al. High Level Calcineurin Activity Predisposes Neuronal Cells to Apoptosis[J].J Biol Chem，1999，274（11）：34450-34458.

[7] 季恩飛，劉學(xué)文.p38MAPK信號(hào)通路抑制劑對NMDA誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，51（11）：10-15.

[8] 高玲，賀偉，曹延平，等.神經(jīng)鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)IL-1β引起的皮層神經(jīng)元損傷 [J].中外醫(yī)療，2013，32（36）：32-33.

（收稿日期：2014-10-27）endprint