李國(guó)鋒， 葛 敏， 呂遠(yuǎn)大

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地，江蘇 南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

玉米作為世界最大的種植作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位，全球?qū)ζ湫枨罅空诓粩嗯噬?。醇溶蛋?Zein)是玉米最主要的儲(chǔ)藏蛋白(占籽?？偟鞍椎?0%以上［1-2］)，對(duì)玉米籽粒品質(zhì)有重要影響。醇溶蛋白根據(jù)其溶解性、氨基酸組成以及其他物理性質(zhì)可以分為α、β、γ和δ 4類，其中α-醇溶蛋白(α-zein)占總醇溶蛋白的60%，含量最為豐富。玉米α-醇溶蛋白富含谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸，但缺乏賴氨酸、色氨酸等幾種人體和動(dòng)物必需的氨基酸，且因聚集二硫鍵和糖基化的作用而難溶于水，在非反芻動(dòng)物體內(nèi)不易消化吸收，故其食用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不高［3-4］。Prasanna等［5］通過(guò) SDS-PAGE電泳分析成熟籽粒中醇溶蛋白含量，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米籽粒中醇溶蛋白含量較普通玉米顯著較低，尤其是α-醇溶蛋白，因此降低α-醇溶蛋白含量一度成為提高玉米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)研究的重要目標(biāo)之一。然而研究結(jié)果表明，過(guò)低的α-醇溶蛋白雖可提高胚乳蛋白質(zhì)中賴氨酸和色氨酸的含量并大大改善玉米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，但同時(shí)引起玉米胚乳質(zhì)地松軟和產(chǎn)量無(wú)法提高等問(wèn)題［6］。

α-醇溶蛋白由一個(gè)龐大的超級(jí)基因家族編碼，根據(jù)序列相似性又分為4個(gè)基因亞族:z1A、z1B、z1C、z1D，其中z1A、z1B和z1D 3個(gè)基因亞族屬于19 000 α-醇溶蛋白，z1C為22 000 α-醇溶蛋白［7-8］。Song等［6］利用BAC文庫(kù)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在玉米B73自交系中19 000 α-醇溶蛋白基因家族組成了玉米基因組上最長(zhǎng)的連續(xù)重復(fù)基因序列區(qū)域，19 000 α-醇溶蛋白基因家族中，z1A包含12個(gè)基因成員，z1B包含8個(gè)基因成員，z1D包含5個(gè)成員，它們分別位于3條染色體(第1、第4、第7條染色體)的4個(gè)不同基因組區(qū)域內(nèi)。這25個(gè)基因成員DNA序列較為保守且基因轉(zhuǎn)錄方向基本一致(Head-to-tail orientation)，但是其中只有12個(gè)基因具有完整的編碼區(qū)域，另外13個(gè)基因由于突變等未知原因無(wú)法形成完整的轉(zhuǎn)錄本。Song等［8-9］利用BAC文庫(kù)測(cè)序，基于比較基因組學(xué)分析，在 B73和 BSSS53自交系中，發(fā)現(xiàn)22 000 α-醇溶蛋白基因家族分別由15個(gè)和23個(gè)成員組成，它們位于第4號(hào)染色體的短臂上。z1C成員大致上是呈現(xiàn)串聯(lián)陣列，基因轉(zhuǎn)錄方向完全一致。而在第4號(hào)染色體的短臂上距離著絲粒-20 cM另外一個(gè)區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)游離于串聯(lián)陣列之外的z1C成員floury2。這些z1C成員在B73和BSSS53中分別只有7個(gè)和8個(gè)具有完整的編碼區(qū)域。盡管α-醇溶蛋白超級(jí)基因家族的大小和復(fù)雜度在不同的自交系中有所不同，但是序列卻高度保守。

Feng等［10］結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR和隨機(jī)克隆測(cè)序的研究方法，對(duì)玉米自交系B73胚乳發(fā)育時(shí)期α-醇溶蛋白超基因家族(41個(gè)基因成員)的表達(dá)模式進(jìn)行研究，結(jié)果表明該基因家族中僅18個(gè)基因表達(dá)，表達(dá)水平差異很大。該家族所有亞族(z1A、z1B、z1C、z1D)在授粉后10～34 d均表現(xiàn)出上下擺動(dòng)不規(guī)則的表達(dá)模式，總體而言z1A具有最高表達(dá)量，然后表達(dá)量由高到低依次為z1C、z1D和z1B。亞族基因成員的表達(dá)模式也存在顯著差異，但是，由于α-醇溶蛋白基因家族成員在編碼序列存在高度的相似性，實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)部分基因無(wú)法精確區(qū)分。二代測(cè)序技術(shù)如RNA-seq具有高敏感性和高通量等特征，可精確檢測(cè)到基因家族中相似基因的不同轉(zhuǎn)錄本的單堿基差異。利用RNA-seq獲得的高通量數(shù)據(jù)結(jié)合序列相似性比較和覆蓋深度計(jì)算，可以對(duì)玉米α-醇溶蛋白基因家族成員基因表達(dá)進(jìn)行高精度解析。

玉米中首個(gè)發(fā)現(xiàn)能調(diào)控α-醇溶蛋白的反式因子為Opaque2(O2)，屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，O2基因在玉米胚乳中特異表達(dá)。O2突變體中α-醇溶蛋白基因的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致籽粒中賴氨酸和色氨酸的含量增加，但也導(dǎo)致籽粒胚乳粉質(zhì)呈現(xiàn)出不透明的表型［11-13］?；谏鲜鲈蛟撏蛔凅w廣泛應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)蛋白玉米種質(zhì)資源的創(chuàng)制研究，但是Opaque2對(duì)α-醇溶蛋白基因家族成員的表達(dá)是否均存在影響并沒(méi)有得到很好的解析。

本研究擬根據(jù)α-醇溶蛋白基因家族成員的保守序列修訂該基因家族在玉米B73染色體上的位置，并利用RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)玉米自交系B73胚乳中從授粉至成熟各時(shí)期編碼α-醇溶蛋白的各個(gè)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，解析該基因家族成員的表達(dá)特性，并通過(guò)隨機(jī)克隆Sanger測(cè)序法對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)比較Opaque2野生型和突變型的編碼α-醇溶蛋白基因家族成員的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 玉米α-醇溶蛋白基因的鑒定與分類

基與最新版(V3)玉米自交系B73參考基因組數(shù)據(jù)(http://www.maizegdb.org/)，利用tBlastx方法以α-醇溶蛋白cDNAs(NCBI)為目標(biāo)序列在玉米基因組中搜尋同源區(qū)域，并利用生物信息學(xué)方法獲得同源區(qū)域?qū)?yīng)基因的位置及核酸序列。然后利用ClustalX軟件對(duì)玉米α-醇溶蛋白基因進(jìn)行多重序列比對(duì)，并根據(jù)序列相似性進(jìn)行人工校正分類。

1.2 玉米α-醇溶蛋白基因保守Motif分析

為了進(jìn)一步解析α-醇溶蛋白基因的結(jié)構(gòu)和保守性，我們利用MEME在線分析工具［14］(http:// meme-suite.org/index.html)對(duì)本研究所鑒定的玉米α-醇溶蛋白基因的保守Motif進(jìn)行分析。其中最大保守motif數(shù)目設(shè)置為10條，motif長(zhǎng)度設(shè)置為6～50 bp。

1.3 玉米α-醇溶蛋白基因的表達(dá)譜分析及驗(yàn)證

為了進(jìn)一步解析玉米α-醇溶蛋白基因表達(dá)模式，我們利用玉米自交系B73胚乳自授粉到成熟17個(gè)發(fā)育時(shí)期RNA-Seq數(shù)據(jù)［15］，系統(tǒng)分析α-醇溶蛋白基因在玉米B73中的表達(dá)譜模式。RNA-Seq數(shù)據(jù)的處理及α-醇溶蛋白基因家族表達(dá)量FPKM值的獲得均參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究方法［16］，最終利用MEV4.9軟件繪制玉米 α-醇溶蛋白基因家族的Heatmap圖，并分析表達(dá)模式。為驗(yàn)證本研究所利用RNA-Seq測(cè)序結(jié)果的可靠性，利用隨機(jī)克隆Sanger測(cè)序法對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，比較2種測(cè)序方法中玉米B73授粉14 d后胚乳中α-醇溶蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的一致性。

1.4 Opaque2對(duì)玉米α-醇溶蛋白基因表達(dá)的影響

利用 Li等［17］文章中野生型和突變體 O-paque2授粉后15 d籽粒的RNA-seq數(shù)據(jù)，并對(duì)其進(jìn)行處理。最終整理出野生型和突變體中α-醇溶蛋白基因家族所有成員的相對(duì)表達(dá)量，比較分析轉(zhuǎn)錄因子Opaque2對(duì)玉米α-醇溶蛋白基因表達(dá)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米α-醇溶蛋白基因的確定及分類

利用tBlastx方法在玉米基因組中共比對(duì)搜索到39條α-醇溶蛋白基因序列。利用ClustalX軟件對(duì)基因序列進(jìn)行多重比對(duì)和人工校正，玉米α-醇溶蛋白基因分類結(jié)果見表1(參照前人研究結(jié)果對(duì)其命名)，其中28條序列與目標(biāo)序列相似度為100.00%，其余11條序列相似度高達(dá)97.75%以上，說(shuō)明本研究比對(duì)結(jié)果可信度高。z1A亞族包含12個(gè)基因成員(Z19A1-1～Z19A1-9，Z19A2-1～Z19A2-3);z1B包含8個(gè)成員(Z19B1-1～Z19B1-6，Z19B2-1～Z19A2-2); z1D包含5個(gè)成員(Z19D1-1～Z19D1-3，Z19D2-1，Z19D3-1)，3個(gè)亞族分別位于第4、第7和第1染色體上;z1C亞族14個(gè)成員位于第4染色體上，其中13個(gè)呈現(xiàn)串聯(lián)陣列轉(zhuǎn)錄方向完全一致，僅AZS22-16游離于串聯(lián)陣列之外，該基因?yàn)閒loury2。19 000 α-醇溶蛋白共25個(gè)(z1A、z1B和z1D)，22 000 α-醇溶蛋白共14個(gè)(z1C)。α-醇溶蛋白超家族基因長(zhǎng)度均值為872 bp，其中z1B亞族基因長(zhǎng)度均值最長(zhǎng)(1 507 bp)，其余3個(gè)亞族(z1A、z1C和z1D)基因長(zhǎng)度均值相近，約700 bp。39個(gè)α-醇溶蛋白基因家族中有30個(gè)可以對(duì)應(yīng)到前人預(yù)測(cè)的基因ID上，9個(gè)基因還未預(yù)測(cè)出基因ID的表示為“-”。

2.2 玉米α-醇溶蛋白基因保守Motif分析

通過(guò)MEME在線分析工具對(duì)本研究所鑒定的39個(gè)α-醇溶蛋白基因的保守motif進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1(圖中α-醇溶蛋白基因家族成員按照比對(duì)E值大小排列)所示。圖1顯示，α-醇溶蛋白基因家族成員含有的保守motif數(shù)目和排列位置總體相似度高，尤其在各亞族成員間相似性非常高，說(shuō)明該家族基因序列高度保守。10條motif長(zhǎng)度為40～50 bp，其中motif 6含量最為豐富，在α-醇溶蛋白基因中存在2～4個(gè)重復(fù)，此外motif 9、motif 5和motif 1也存在重復(fù)。α-醇溶蛋白基因家族中AZS22-3、AZS22-11、AZS22-16、Z19D1-1、Z19A1-9基因所含motif少(1～4個(gè))，其余基因家族成員含有motif數(shù)目較為一致。

表1 玉米α-醇溶蛋白基因Table 1 α-zein gene family in maize

圖1 玉米α-醇溶蛋白基因保守motif分析Fig.1 Conserved motif analyses of α-zein genes in maize

2.3 玉米籽粒發(fā)育時(shí)期α-醇溶蛋白基因表達(dá)譜分析

對(duì)玉米胚乳自授粉至成熟17個(gè)發(fā)育時(shí)期RNASeq數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和統(tǒng)計(jì)分析后，獲得了玉米α-醇溶蛋白基因?qū)?yīng)表達(dá)量的FPKM值，根據(jù)FPKM值利用MEV4.9軟件繪制出表達(dá)量的Heatmap圖譜(圖2)。玉米α-醇溶蛋白基因家族成員表達(dá)模式差異較大，Z19A1-9、Z19D1-1和AZS22-13這3個(gè)基因表達(dá)量最低，在圖2中17個(gè)時(shí)期FPKM均值低于1，Z19A1-1、Z19A1-8、Z19B2-2、Z19D1-3、Z19D3-1和AZS22-11這6個(gè)基因表達(dá)量也很低，F(xiàn)PKM均值低于50，Z19A2-2表達(dá)量最高，F(xiàn)PKM均值為29 176。其中α-醇溶蛋白超家族4個(gè)亞族表達(dá)量 FPKM均值大小依次為 z1A (13 593)、z1B(4 910)、z1C(4 187)和z1D(2 589)。

玉米α-醇溶蛋白基因在胚乳中從授粉后10 d開始表達(dá)，授粉38 d后醇溶蛋白基因幾乎不表達(dá)。α-醇溶蛋白z1A亞族約58%(7/12)的成員和z1B亞族約25%(2/8)的成員在授粉12～32 d后的胚乳中表達(dá)量持續(xù)較高，z1D亞族約40%(2/5)的成員在授粉后28 d的胚乳中出現(xiàn)最高表達(dá)量，z1C亞族約43%(6/14)的成員在授粉22～28 d后的胚乳中表現(xiàn)出最高的表達(dá)量。

為驗(yàn)證本研究所利用RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性，我們將α-醇溶蛋白基因家族成員在授粉14 d后Sanger測(cè)序與二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了比較。如表1所示，2種測(cè)序方法所得表達(dá)量數(shù)值非常一致，說(shuō)明本研究分析所得α-醇溶蛋白基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)非?？尚?。

圖2 玉米α-醇溶蛋白基因表達(dá)模式分析Fig.2 Expression patterns of α-zein genes in maize

2.4 Opaque2對(duì)玉米 α-醇溶蛋白基因表達(dá)的影響

根據(jù)野生型和突變體Opaque2授粉后15 d籽粒的RNA-seq數(shù)據(jù)，最終整理出野生型和突變體中α-醇溶蛋白基因相對(duì)表達(dá)量。如圖3所示，突變體中z1C亞族成員相對(duì)表達(dá)量較野生型顯著下調(diào)，z1A亞族成員表達(dá)量略有下調(diào)，但z1B和z1D亞族成員表達(dá)量沒(méi)有顯著的變化。以上結(jié)果說(shuō)明Opaque2突變主要影響z1C基因亞族成員的表達(dá)，而對(duì)z1B和 z1D的表達(dá)影響不顯著，轉(zhuǎn)錄因子Opaque2為z1C亞族基因表達(dá)所必須的反式作用因子。

3 討論

本研究基于玉米v3版基因組數(shù)據(jù)共鑒定α-醇溶蛋白基因39個(gè)，其中19 000 α-醇溶蛋白家族成員25個(gè)，22 000 α-醇溶蛋白家族成員 14個(gè)。Song等［8］在玉米BSSS53中共鑒定22 000 α-醇溶蛋白23個(gè)，Song等［7］在玉米B73中鑒定19 000 α-醇溶蛋白25個(gè)，Song等［8］分別在玉米 B73和 BSSS53鑒定22 000 α-醇溶蛋白15個(gè)和23個(gè)，Xu等［18］報(bào)道玉米B73中19 000和22 000 α-醇溶蛋白數(shù)目分別為26個(gè)和15個(gè)，F(xiàn)eng等［9］在玉米B73中鑒定出19 000和22 000 α-醇溶蛋白數(shù)目分別為25個(gè)和16個(gè)。2011年Miclaus等［19］發(fā)現(xiàn)玉米B73中α-醇溶蛋白有41個(gè)(19 000和22 000 α-醇溶蛋白分別為26個(gè)和15個(gè))，BSSS53中 α-醇溶蛋白有 48個(gè)(19 000和22 000 α-醇溶蛋白分別25個(gè)和23個(gè))。以上結(jié)果顯示不同時(shí)期所鑒定的玉米α-醇溶蛋白基因數(shù)目有所不同，目前仍沒(méi)有一致結(jié)果。本研究是在前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中所有α-醇溶蛋白基因的cDNA序列在玉米基因組中搜尋同源序列，并利用生物信息學(xué)方法定位到相關(guān)基因并對(duì)其位置進(jìn)行修正，還得到對(duì)應(yīng)基因的預(yù)測(cè)基因ID?？傮w而言，本研究所鑒定的玉米α-醇溶蛋白基因家族更為全面和準(zhǔn)確，為進(jìn)一步研究該基因家族提供了一定的依據(jù)。

α-醇溶蛋白基因家族各亞族成員在第1、第4和第7條染色體6個(gè)區(qū)域內(nèi)分布，與Miclaus等［19］研究結(jié)果相似。通過(guò)對(duì)α-醇溶蛋白基因家族的保守motif分析發(fā)現(xiàn)該家族基因序列高度保守，某些motif存在重復(fù)現(xiàn)象。以上結(jié)果說(shuō)明α-醇溶蛋白基因家族在進(jìn)化上同源關(guān)系很近，存在串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象。Feng等［10］發(fā)現(xiàn)α-醇溶蛋白基因家族41個(gè)成員中僅18個(gè)基因表達(dá)。本研究利用RNA-seq獲得高通量數(shù)據(jù)，結(jié)合序列相似性比較和覆蓋深度計(jì)算，發(fā)現(xiàn)玉米α-醇溶蛋白基因家族中大部分基因均表達(dá)(約30個(gè))，以上結(jié)果說(shuō)明RNA-seq技術(shù)具有高敏感性，可精確檢測(cè)到基因家族中相似基因不同轉(zhuǎn)錄本的單堿基差異。

圖3 Opaque 2對(duì)玉米α-醇溶蛋白基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Opaque 2 on the expression of α-zein genes in maize

α-醇溶蛋白受順式因子和反式因子協(xié)同調(diào)控。保守的順式因子主要位于α-醇溶蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約300 bp處，這一保守區(qū)被稱為胚乳盒。胚乳盒含有3類不同的保守序列模塊:第1類是胚乳模塊(EMs);第2類是GCN4結(jié)合位點(diǎn)類似模塊(GLMs);第3類是醇溶谷蛋白盒(P盒)。P盒序列與EMs序列相同。P盒和GLMs可以介導(dǎo)α-醇溶蛋白基因的胚乳特異性表達(dá)。玉米中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)調(diào)控α-醇溶蛋白的反式因子是一個(gè)bZIP類蛋白，稱為Opaque2(O2)，O2基因在玉米胚乳中特異表達(dá)，所編碼的蛋白結(jié)合GLMs位點(diǎn)，正向調(diào)控玉米22 000 α-醇溶蛋白、b-32基因和cyPPDK1基因的表達(dá)［13］。Vicente-Carbajosa等［20］發(fā)現(xiàn)另一個(gè)調(diào)節(jié)α醇溶蛋白基因表達(dá)的反式因子PBF(Prolamin box binding factor)，PBF屬于植物Cys2-Cys2鋅指結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合蛋白Dof成員，?；越Y(jié)合在α-醇溶蛋白基因啟動(dòng)子的P盒區(qū)。同樣，PBF蛋白質(zhì)可以特異地與bZIP蛋白質(zhì)相互作用，促進(jìn)bZIP蛋白質(zhì)與啟動(dòng)子中靶序列的結(jié)合。PBF和O2在玉米胚乳組織中以相同的方式表達(dá)，都是在玉米醇溶蛋白基因轉(zhuǎn)錄激活之前開始積累。O2與PBF的相互作用對(duì)于玉米醇溶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄激活是非常必要的［21］。O2的自然突變或RNAi抑制可顯著降低22 000 α-醇溶蛋白和其他α-醇溶蛋白基因的表達(dá)，導(dǎo)致胚乳粉質(zhì)、產(chǎn)量及千粒質(zhì)量降低，籽粒水分含量偏高，易破碎和易感染病蟲害，因而使O2的自然突變無(wú)法直接用于育種［22-23］。目前，未見有關(guān)PBF的自然突變或RNAi抑制后導(dǎo)致玉米性狀表現(xiàn)改變的報(bào)道，究其原因?yàn)镻BF除了參與α-醇溶蛋白的調(diào)控，還可能涉及到種子發(fā)育的其他關(guān)鍵途徑。本研究發(fā)現(xiàn)α-醇溶蛋白基因家族序列高度保守，但表達(dá)譜差異較大，可能與上述順式和反式協(xié)同調(diào)控有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Opaque2主要調(diào)控z1C亞族(22 000 α-醇溶蛋白)的表達(dá)(與前人研究結(jié)果一致)［12］，對(duì)z1A亞族的表達(dá)也有影響，但對(duì)z1B和z1D亞族的表達(dá)影響作用不明顯。

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