劉如秀 彭杰 劉宇

病態(tài)竇房結(jié)綜合征(sick sinus syndrome，SSS)是由于竇房結(jié)或其周?chē)M織病變，導(dǎo)致沖動(dòng)形成和傳出障礙而產(chǎn)生的心律失常和一系列臨床表現(xiàn)的綜合征。通陽(yáng)活血方是劉志明老中醫(yī)臨證70余年治療SSS的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效確切［1］。本實(shí)驗(yàn)采用酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞分析儀、激光共聚焦顯微鏡，觀察通陽(yáng)活血方含藥血清對(duì)模擬缺血再灌注兔竇房結(jié)細(xì)胞凋亡和骨架蛋白形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，探討其對(duì)體外培養(yǎng)竇房結(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生24小時(shí)內(nèi)新西蘭乳兔，雌雄不拘，由北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，批號(hào):11401400000095。

1．2 實(shí)驗(yàn)藥物

通陽(yáng)活血方藥物組成:附子6 g、紅參10 g、當(dāng)歸12 g、黃芪 18 g、三七 3 g，經(jīng)水煎醇提法制成含1 g/mL生藥的無(wú)菌中藥原液。含藥血清制備方法:取成年新西蘭大耳白兔40只(由北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，批號(hào):11401400000095)，雌雄各半，用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組10只，通陽(yáng)活血方含藥血清大劑量組按照每日生藥量54．96 g/kg·體質(zhì)量(相當(dāng)于70 kg成人臨床用藥量12倍)、中劑量組按照每日生藥量27．48 g/kg·體質(zhì)量(相當(dāng)于70kg成人臨床用藥量6倍)、小劑量組按照每日生藥量13．74 g/kg·體重(相當(dāng)于70 kg成人臨床用藥量3倍)，分別用蒸餾水配置成混懸液給兔灌胃，每天2次，連續(xù)7天;空白血清組給予等量正常飲用水。末次給藥前禁食不禁水12小時(shí)，給藥后2小時(shí)，耳中央動(dòng)脈取血，自然分離血清，56℃水浴30分鐘滅活處理，0．2μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝為通陽(yáng)活血方含藥血清大、中、小劑量組和空白血清組，－20℃冷存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 試劑

DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(美國(guó) Thermo公司產(chǎn)品，批號(hào):NVJ0307);胎牛血清(美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，批號(hào):911585);低糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品，批號(hào):DM121501D);胰酶(美晨公司，批號(hào):C1401130);PI-Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部制劑室);一抗:Monoclonal Anti-Vinculin antibody(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào):SAB4200080);二抗:Gote Anti-Mouse IgG(H+L)Rhodamine(TRITC)(美國(guó) Bioworld公司產(chǎn)品，批號(hào):BS11502)。

1．4 主要儀器

酶標(biāo)儀(550型，美國(guó));流式細(xì)胞分析儀(BD，美國(guó));激光共聚焦顯微鏡(TCS-NT型，德國(guó));防震臺(tái)(TMC63544，美國(guó))。

1．5 方法

1．5．1 竇房結(jié)細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 新生24小時(shí)內(nèi)的乳兔8只，吸入乙醚麻醉，用75%酒精消毒乳兔皮膚及手術(shù)區(qū)。沿前正中線剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，將心底部大血管剪斷，游離心臟，盡量保留大血管，用PBS充分清洗心臟，解剖鏡下分離竇房結(jié)區(qū)域(上腔靜脈與右心房交界處)，用PBS清洗分離的組織，剪碎呈約0．5mm，置于15 mL離心管中，加入0.1%胰酶10 mL，37℃下，消化15分鐘，消化完畢，加入5 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，用移液槍上下吹打70次，離心400 r/min，5分鐘，將上清液移入另一50 mL離心管，將沉淀的組織塊再加入0.1%胰酶10 mL，同前法消化，終止消化后，吹打，離心，取上清細(xì)胞懸液與第一次的細(xì)胞懸液合并，如此重復(fù)一次，將三次所得的細(xì)胞懸液合并至50 mL離心管，1500 r/min離心10分鐘，棄上清，用含血清培養(yǎng)基6 mL重新懸浮細(xì)胞。取4個(gè)10cm培養(yǎng)皿，各加入10 mL培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液等分移入培養(yǎng)基中，置于37℃、CO2濃度5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)(差速貼壁)，光鏡下觀察，可見(jiàn)大量纖維細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞貼壁，將上浮細(xì)胞取出置于另4個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24小時(shí)后更換新培養(yǎng)基，之后每48小時(shí)更換培養(yǎng)基。

1．5．2 模擬缺血再灌注模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 以缺氧缺糖模擬缺血，以恢復(fù)氧和糖的供應(yīng)模擬再灌注，用不含胎牛血清的低糖培養(yǎng)基置換原培養(yǎng)基，放入自制的密閉盒中，持續(xù)通以N2充分排盡盒內(nèi)空氣，以模擬缺血。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)后從密閉盒中取出，更換為正常培養(yǎng)基，以模擬再灌注培養(yǎng)3小時(shí)。

將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組、空白血清組、含藥血清高、中、低劑量組。含藥血清高、中、低劑量組及空白血清組分別加入相應(yīng)兔血清(終濃度10%)，預(yù)先培養(yǎng)過(guò)夜(約8小時(shí))。造模更換培養(yǎng)基時(shí)加入相應(yīng)含藥血清，造模后取竇房結(jié)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．5．3 細(xì)胞活性檢測(cè) 將細(xì)胞種植于96孔板中，分組，每組取8個(gè)復(fù)孔，造模后，倒棄培養(yǎng)基，相應(yīng)檢測(cè)孔內(nèi)加入噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)工作液100μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3小時(shí)，取出吸除MTT工作液，加入DMSO100μL，搖勻，待顏色變化，立即上酶標(biāo)儀檢測(cè)(設(shè)定波長(zhǎng)570mm)。

1．5．4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度為(5×105)～(1×106)個(gè)/mL。分組，每組6個(gè)樣本，造模后，將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至流式離心管內(nèi)，1500rpm，4℃離心5分鐘，棄上清。加入1 mL預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，同上法離心，棄上清，重復(fù)3～4次，加入200ul Binding Buffer，輕輕震蕩，使細(xì)胞懸浮。加入10μL Annexin V-FITC，輕輕搖勻，避光，室溫反應(yīng)15分鐘，加入5ul PI，即上機(jī)檢測(cè)。

1．5．5 細(xì)胞骨架蛋白tubulin形態(tài)觀察14mm蓋玻片放入24孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞貼壁后，選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分組，造模后吸除培養(yǎng)基，PBS清洗2次，以4%多聚甲醛固定10分鐘;吸除多聚甲醛，加入0．02%Triton，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置15分鐘打孔。PBS清洗3次，加入一抗(1∶500PBS溶液)，放入濕盒內(nèi)，4℃冰箱孵育過(guò)夜;PBS清洗2次，加入二抗(1∶200PBS溶液)常溫孵育1小時(shí)，甘油封片后上機(jī)檢測(cè)，每組取4個(gè)視野，圖像采用Image-Pro Plus 6．0進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度分析。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)程序包SPSS13．0軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，多組間資料比較采用完全隨機(jī)方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異顯著，以 P＜0．01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2．1通陽(yáng)活血方含藥血清對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞活性的影響

MTT比色檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組活細(xì)胞量明顯低于空白對(duì)照組(P＜0．01)，證明造模方法可行。空白血清組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，表明兔血清對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)明顯干擾，含藥血清高、中、低劑量組活細(xì)胞量明顯高于模型組(P＜0．05)，顯示通陽(yáng)活血方含藥血清能保護(hù)竇房結(jié)細(xì)胞活性，見(jiàn)表1。

2．2 通陽(yáng)活血方含藥血清對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)結(jié)果如圖1顯示，模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組(P＜0．01)?？瞻籽褰M與模型組無(wú)明顯差異，含藥血清高、中劑量組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組(P＜0．05)，低劑量組凋亡率與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2．3 通陽(yáng)活血方含藥血清對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞骨架蛋白Vinculin的影響

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)Vinculin顯色明顯，數(shù)量較多，均勻分布于細(xì)胞膜附近(圖D);模擬缺血再灌注后的竇房結(jié)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Vinculin數(shù)量明顯減少(圖C)，平均熒光強(qiáng)度明顯低于空白對(duì)照組(P＜0．01)(表1);含藥血清高劑量組Vinculin數(shù)量較模型組明顯增多，顯色明顯(圖D)，平均熒光強(qiáng)度明顯高于模型組(P＜0．01)(表1);中劑量組Vinculin數(shù)量較空白組有所減少，但明顯優(yōu)于模型組(圖E);空白血清組及低劑量組Vinculin數(shù)量較模型組無(wú)明顯差異(圖B、D)?？梢?jiàn)通陽(yáng)活血方含藥血清能保護(hù)缺血再灌注竇房結(jié)細(xì)胞Vinculin的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

表1 各組兔竇房結(jié)細(xì)胞活性、凋亡率及平均熒光強(qiáng)度

圖1 各組流式細(xì)胞分析圖像

3 討論

細(xì)胞凋亡在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育成熟中具有重要的作用，竇房結(jié)、房室結(jié)與傳導(dǎo)阻滯細(xì)胞的胚胎發(fā)育及出生后數(shù)周的發(fā)育過(guò)程中均有細(xì)胞凋亡發(fā)生，在竇房結(jié)的發(fā)育、成熟過(guò)程中，凋亡不足可留下引發(fā)心率失常的基礎(chǔ)，凋亡過(guò)度可引起病態(tài)竇房結(jié)綜合征等病變［2］。模擬缺血再灌注可誘導(dǎo)培養(yǎng)竇房結(jié)細(xì)胞凋亡，且隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，竇房結(jié)細(xì)胞凋亡率逐漸增加［3］。鑒于病竇的發(fā)病常伴隨缺血性心臟病的出現(xiàn)，故竇房結(jié)缺血再灌注損傷所致的細(xì)胞凋亡可能是其病因之一。

心肌骨架系統(tǒng)破壞是缺血再灌注損傷主要的發(fā)生機(jī)制［4］，Vinculin是細(xì)胞骨架系統(tǒng)中重要成分之一，Vinculin在細(xì)胞中與細(xì)胞微絲骨架相連，并將微絲錨定于細(xì)胞膜上，vinculin也介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架的連接，Vinculin在維持細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)、增殖及細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中起重要作用［5］。

圖2 各組Vinculin激光共聚焦顯微鏡圖像

通陽(yáng)活血方是劉志明老中醫(yī)臨證70余年治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的有效經(jīng)驗(yàn)方。劉老認(rèn)為病竇的病機(jī)為心腎陽(yáng)虛、瘀血阻滯，主要證候?yàn)殛?yáng)虛血瘀。心陽(yáng)不振，心脈失于溫煦鼓動(dòng)，氣血運(yùn)行不利;心陽(yáng)不能外達(dá)，導(dǎo)致陽(yáng)氣郁閉不通，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，治宜以“通陽(yáng)活血”為基本法則。通陽(yáng)活血方由附子、人參、當(dāng)歸等組成。附子辛甘性熱，能溫心腎之陽(yáng);人參大補(bǔ)元?dú)?，能助附子之溫，振奮心陽(yáng)，有扶正祛邪之功;當(dāng)歸補(bǔ)血活血，溫通經(jīng)脈，使陽(yáng)氣外達(dá)。諸藥相配，共奏“通陽(yáng)活血”之功。

本實(shí)驗(yàn)MTT檢測(cè)結(jié)果中，模型組與空白對(duì)照組存活細(xì)胞量有明顯差異，表明造模方法可行;空白血清組與模型組無(wú)明顯差異，顯示兔血清對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)無(wú)干擾。含藥血清高、中、低劑量組存活細(xì)胞量都明顯高于模型組，且呈濃度依賴(lài)的量效關(guān)系，表明藥物濃度選取有效可行。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞大量凋亡，證實(shí)缺血再灌注是導(dǎo)致竇房結(jié)細(xì)胞的凋亡的可能原因;含藥血清高、中劑量組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，顯示通陽(yáng)活血方能減少細(xì)胞凋亡是其治療病竇的可能機(jī)制之一。

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示空白對(duì)照組細(xì)胞Vinculin顯色明顯，數(shù)量較多，均勻分布于細(xì)胞膜附近;模型組Vinculin數(shù)量明顯減少，表明缺血再灌注使Vinculin大量裂解;Vinculin的破壞能導(dǎo)致胞質(zhì)中微絲失去錨定點(diǎn)，使骨架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞膜失去支持、脆性增加;細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，從而使竇房結(jié)細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能方面發(fā)生病理改變。而含藥血清高、中劑量組Vinculin都有不同程度的明顯增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通陽(yáng)活血方保護(hù)骨架蛋白Vinculin是其治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的可能機(jī)制之一。

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