李 丹 張金國(guó)

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院2013級(jí)研究生，山東 濟(jì)寧272067；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濟(jì)寧272029）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是目前組織工程建設(shè)的種子細(xì)胞，但因其在骨髓中含量極低，體外細(xì)胞純化、擴(kuò)增培養(yǎng)難度較大，嚴(yán)重影響B(tài)MSCs后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。目前提取方法主要有4種：全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀分離法［1］。由于全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞活性強(qiáng)，增殖旺盛，并且具有操作簡(jiǎn)單，造價(jià)低等優(yōu)點(diǎn)，本文采用貼壁法進(jìn)行體外培養(yǎng)。報(bào)道如下。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重100g左右健康清潔SD大鼠，雌雄不限，由濟(jì)寧魯抗生物有限公司提供。

1．2 試劑及儀器

1．2．1 試劑 DMEM／F12 1∶1（Gibco公司）；胎牛血清（Gibco公司）；0．25%胰蛋白酶（Gibco公司）；青鏈霉素混合液（genview公司）；CD90、CD45抗大鼠熒光表面抗體（eBioscience公司）。

1．2．2 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；倒置顯微鏡（OLYMPOS公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Thermo公司）。

1．3 大鼠BMSCs體外培養(yǎng)體系的建立及鑒定

1．3．1 大鼠BMSCs的提取 稱取100g左右健康清潔SD大鼠一只，脫臼處死后完全浸泡于75%

酒精中5min。將大鼠置于滅菌后的手術(shù)臺(tái)上，依次剪開皮膚、皮下組織，剝離肌肉，完整取下雙側(cè)股骨及脛骨，放置裝有PBS的無菌培養(yǎng)皿中，清除肌肉組織，并用PBS反復(fù)沖洗3遍。在超凈臺(tái)內(nèi)剪開雙側(cè)骨端，用1ml針頭吸取含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨體發(fā)白，將骨髓液收集至15ml離心管中，1000rpm，5min離心，收集細(xì)胞。

1．3．2 大鼠BMSCs的體外培養(yǎng) 用5ml含10%完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，反復(fù)吹打，制備單一細(xì)胞懸液。在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，以1×109／L密度接種于25cm2的細(xì)胞瓶中，置于37℃，CO2濃度為5%的飽和適度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。72h后全量換液，并用PBS反復(fù)沖洗，將懸浮細(xì)胞去除。每間隔2d換液，第7天細(xì)胞融合至80%左右，胰酶消化，并嚴(yán)格控制消化時(shí)間，待鏡下觀察梭形細(xì)胞變形后，立即用完全培養(yǎng)基5ml終止消化，收集細(xì)胞懸液，1000rpm，5min離心。將收集的細(xì)胞以1∶2接種于25cm2的細(xì)胞瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，依次傳代記為P1，P2，P3等。

1．3．3 大鼠BMSCs的表型鑒定 取P3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，胰酶消化后，PBS反復(fù)沖洗兩遍，收集離心后的細(xì)胞，根據(jù)流式細(xì)胞熒光抗體的要求，按每管1×106／L密度置于4個(gè)流式專用上機(jī)管中，分別加入CD90抗體和同型、CD45抗體和同型各5μl，充分混勻細(xì)胞懸液后，避光靜置15min后，各管加入1ml PBS，1200rpm，離心5min，洗滌細(xì)胞。用400μl PBS重懸細(xì)胞后上機(jī)，根據(jù)收集的熒光信號(hào)，判斷細(xì)胞陽性率。

1．3．4 操作注意事項(xiàng) 1）提取、培養(yǎng)細(xì)胞過程中嚴(yán)格無菌操作，添加必要抗生素，減少污染概率。2）提取過程中注意保持股骨端的完整性，避免其它雜細(xì)胞的污染。3）反復(fù)吹打獲得的細(xì)胞懸液，制備單一的細(xì)胞懸液，有利于BMSCs的貼壁生長(zhǎng)。4）避免反復(fù)觀察細(xì)胞，嚴(yán)格控制首次換液時(shí)間，減少培養(yǎng)液晃動(dòng)對(duì)細(xì)胞的不利影響。

2 結(jié)果

2．1 大鼠BMSCs的形態(tài)特征

提取細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，呈大小不一的圓形，懸浮于培養(yǎng)液中。24h后瓶?jī)?nèi)出現(xiàn)少量貼壁細(xì)胞，呈梭形、橢圓形、多角形等，小片狀聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。72h后首次全量換液，去除不貼壁的造血細(xì)胞等懸浮細(xì)胞，可見貼壁細(xì)胞增多，呈現(xiàn)梭形、紡錘形，呈片狀聚集生長(zhǎng)。2天后換液，細(xì)胞增長(zhǎng)速度明顯增快，生長(zhǎng)逐漸融合，繼續(xù)培養(yǎng)至7d，細(xì)胞融合達(dá)80%左右，梭形細(xì)胞為主，胰酶消化傳代至P3代時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較前明顯增快，梭形細(xì)胞克隆狀生長(zhǎng)，形態(tài)趨于穩(wěn)定。見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間BMSCs貼壁情況

2．2 大鼠BMSCs的鑒定結(jié)果

取生長(zhǎng)旺盛的P3代細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定：CD90陽性表達(dá)率99．2%，CD45陽性表達(dá)率0．9%，符合BMSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)，說明原代培養(yǎng)的BMSCs具有純度高，均一性強(qiáng)的特性。見圖2。

3 討論

BMSCs因其自身具有多向分化潛能，取材容易，體外培養(yǎng)后可以高度純化、大量擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，成為組織工程的種子細(xì)胞，已被應(yīng)用于許多領(lǐng)域的研究，并成功誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、心肌等細(xì)胞［2－5］，使得多年以來干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，干細(xì)胞的移植治療始終是研究的熱點(diǎn)［6－7］，目前這些研究已初步取得一定療效［8］，為臨床疾病的治療提供了新思路，為臨床患者帶來曙光。

本實(shí)驗(yàn)成功分離、提取大鼠BMSCs。采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法建立體外培養(yǎng)體系，經(jīng)表面抗原表型鑒定為純化BMSCs，并通過嚴(yán)格控制消化時(shí)間，嚴(yán)格無菌操作，成功實(shí)現(xiàn)BMSCs的體外大量擴(kuò)增，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供細(xì)胞來源，促進(jìn)了干細(xì)胞誘導(dǎo)分化、移植治療的進(jìn)一步研究。并通過總結(jié)實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)，大大提高了BMSCs提取及培養(yǎng)的成功率，避免了培養(yǎng)過程中時(shí)間的浪費(fèi)，節(jié)省了科研經(jīng)費(fèi)，提高了科研的準(zhǔn)確性。

圖2 CD90、CD45表達(dá)情況

BMSCs在骨髓中含量?jī)H0．001%～0．1%，各種分離方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，至今尚無最佳分離培養(yǎng)方案。免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀法因其對(duì)細(xì)胞活性損傷較大，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并且造價(jià)昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高等原因，未能廣泛應(yīng)用。密度梯度離心是根據(jù)骨髓中各種細(xì)胞比重不同，通過加入percon液或淋巴細(xì)胞分離液提取相對(duì)較純的BMSCs，但因多次離心，破壞了BMSCs生存的骨髓微環(huán)境，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。而全骨髓貼壁培養(yǎng)法利用BMSCs的貼壁生長(zhǎng)特性，通過不斷換液，去除懸浮細(xì)胞，是目前操作最簡(jiǎn)單有效的方法。

由于BMSCs細(xì)胞表面尚未有特異抗體表達(dá)，目前多采用陽性表面標(biāo)記物及陰性表面標(biāo)記物相結(jié)合的辦法鑒定。國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)在2006年提出了鑒定人來源的間充質(zhì)干細(xì)胞最低的3條標(biāo)準(zhǔn)［9］：1）必須具備對(duì)塑料底物的貼壁特性。2）CD105、CD90、CD73等陽性表達(dá)率≥95%，而CD45，CD34，CD14或CD11b，CD79a或CD19，HLA－DR等的陽性表達(dá)率≤2%。3）體外誘導(dǎo)分化具有多向分化潛能。本文對(duì)P3代生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞給予標(biāo)記CD90、CD45進(jìn)行表面抗原鑒定，結(jié)果顯示CD90表面抗原陽性，CD45表面抗原陰性，雖然大鼠與人物種存在差異，但目前鑒定標(biāo)準(zhǔn)仍采用2006年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［10］。

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