劉 麗， 鐘嘉明， 陳曉霞， 丁 寧， 錢其軍， 曲增強

并列第一作者：劉 麗、鐘嘉明

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者多數(shù)就診時已是晚期，已經(jīng)失去手術(shù)指征［1］。TACE是目前晚期肝癌患者首選的治療方式，可以有效控制肝內(nèi)病灶進(jìn)展，但是TACE不能使病灶完全壞死，并且對患者免疫功能造成損傷［2］。經(jīng)過長時間的探索，人們認(rèn)識到腫瘤免疫治療在腫瘤治療中起到重要作用，特別是近年新興的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killers，CIK）在殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)機體免疫功能方面有一定的效果，能在一定程度上降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，目前應(yīng)用CIK細(xì)胞治療肝癌已經(jīng)成為肝癌治療的一種新手段［3］。本研究旨在探討TACE術(shù)聯(lián)合DC-CIK組（治療組）與單純TACE治療組（對照組）在晚期肝細(xì)胞癌治療效果的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 所選病例為2012年9月至2013年9月在上海東方肝膽外科醫(yī)院初次診斷為巴塞羅那（BCLC）C期肝細(xì)胞癌的住院患者。共入組60例，年齡27～75歲，所有患者均合并乙肝病毒感染并有不同程度肝硬化，入組患者隨機分為2組，治療組30例，均行TACE聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞回輸治療。對照組30例，只行TACE治療。患者入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)、AFP明確診斷的肝細(xì)胞癌；②初次診斷，經(jīng)臨床證實為無法行手術(shù)治療的患者，既往未接受過索拉菲尼、微波、射頻、放療等治療；③BCLC肝癌分期為C期：合并門靜脈癌栓或肺轉(zhuǎn)移者；④肝功能為Child-Pugh分期為A或B，無TACE禁忌證者。⑤本研究所有對象已充分了解并自愿簽署知情同意書，報告醫(yī)院倫理委員會經(jīng)批準(zhǔn)后實行。兩組患者一般資料見表1。

1.1.2 主要試劑和儀器 ①TACE治療所用藥物及儀器：表阿霉素、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、超液化碘化油、明膠海綿顆粒，數(shù)字減影血管造影機（digital substraction angiography，DSA）；②流式細(xì)胞分析所需抗體及試劑、儀器：CD3-FITC、CD4-PC5、CD56-PE、CD16-PC5、CD25-APC、CD127-PE 抗體（Beckman公司），紅細(xì)胞裂解液，PBS（磷酸鹽1緩沖液），流式細(xì)胞儀FACScalibur（Becon Dickinson公司產(chǎn)品）；③DC-CIK培養(yǎng)所需儀器與試劑：淋巴細(xì)胞分離液，IL-2（Pepro Tech 公司），Retronectin（TaKaRa公司），AIM-Ⅴ（Gibco 公司），淋巴細(xì)胞分離液（GE公司），血細(xì)胞分離機，微量移液槍（GILSON和EPPENDORF公司），Minispin小型離心機（EPPENDORF 公司），HF90/HF240 CO2培養(yǎng)箱 （力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），超凈工作臺（上?？党呛涂諝鈨艋O(shè)備有限公司）。1.2 方法

表1 治療組和對照組患者一般資料比較 （例）

1.2.1 DC-CIK細(xì)胞體外誘導(dǎo)和擴增 實驗組患者血細(xì)胞分離機采集外周血單核細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)一步分離純化，貼壁2 h后分成2部分處理。①懸浮細(xì)胞：收集接種細(xì)胞（40 ml無血清細(xì)胞培養(yǎng)液重懸分離層細(xì)胞+1 000 u/ml IL-2+1 000 u/mlγ-IFN），加入到包被有 anti-Human CD3（5 μg/ml）+RetroNetin（12.5μg/ml）的一個T75培養(yǎng)瓶中。第 3天，視細(xì)胞生長情況，補1 000 u/ml IL-2（完全培養(yǎng)液）40 ml。第4天轉(zhuǎn)袋，由1個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)至2個培養(yǎng)袋中，400 ml/袋繼續(xù)培養(yǎng)。每2天換液并補充因子。②貼壁細(xì)胞：加入含有 rhGM-CSF（100 ng/ml）、rhIL-4（100 ng/ml）和 FLT3L（50 ng/ml）的 AIM-Ⅴ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)7 d。在第4天補充上述濃度細(xì)胞因子。第6天負(fù)載肝癌抗原。第 7 天加入 TNF-α 100 ng/ml，LPS100 ng/ml，PGE-2 100 ng/ml，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟。

共培養(yǎng)：第8天，收集成熟的DC細(xì)胞，計數(shù)。將成熟的DC細(xì)胞和擴增的CIK細(xì)胞以1∶50的比例共培養(yǎng)。第11天，每袋細(xì)胞添加0.5倍的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液和相應(yīng)的IL-2，計數(shù)并取樣檢查細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素、支原體為陰性，錐蟲藍(lán)染色法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)量，成活率后收集細(xì)胞。生理鹽水 500 ml+IL-2 50萬u+20%人血白蛋白50 ml重懸細(xì)胞加入細(xì)胞回輸袋，分3次回輸給患者。

1.2.2 治療方案 60例患者均行TACE治療，術(shù)中應(yīng)用化療藥物主要為表阿霉素和5-Fu，并應(yīng)用超液化碘化油和明膠海綿顆粒栓塞腫瘤供血血管。2次TACE術(shù)治療間隔時間根據(jù)患者復(fù)查時情況決定，至少間隔1個月。治療組患者TACE治療期間行DC-CIK回輸治療，TACE治療與細(xì)胞回輸至少間隔1周，細(xì)胞回輸前給予12.5 mg鹽酸異丙嗪，從回輸細(xì)胞次日起隔天注射IL-2增強回輸細(xì)胞活性，共注射2周。每次回輸細(xì)胞數(shù)量不低于109個。2次細(xì)胞回輸間隔1個月。

1.2.3 觀察指標(biāo)及療效評定 觀察指標(biāo)包括免疫功能、瘤體及甲胎蛋白（AFP）變化、不良反應(yīng)、半年及1年生存率。流式細(xì)胞儀檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群（CD3+T細(xì)胞，CD3+CD4+T 細(xì)胞，CD3+CD8+T細(xì)胞，CD4+T/CD8+T），調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（CD3+CD4+CD25+CD127+Treg）及 NK 細(xì)胞（CD3+CD16+CD56－）比例，每次復(fù)查均檢測肝功能、血常規(guī)、腫瘤標(biāo)志物、增強CT或MRI，CT掃描儀保存影像資料，其余資料拍照保存。半年、1年時電話隨訪患者生存情況。

1.3 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。TACE治療前后外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量及淋巴細(xì)胞各亞群比例的變化、治療組DC-CIK細(xì)胞回輸前后患者外周血淋巴細(xì)胞亞群比例變化采用配對樣本T檢驗；存活率及臨床療效比較采用生存分析Kaplan-Meier檢驗，臨床樣本特征比較采用χ2檢驗。以α=0.05作為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TACE治療前后淋巴細(xì)胞數(shù)量、T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞比例的變化

60例患者TACE治療前及治療后第3天查血常規(guī)，及抽外周血進(jìn)行T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞檢測。除去實驗組某些患者TACE治療前血細(xì)胞分離機分離外周血單核細(xì)胞影響，共獲得43組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示TACE治療后患者外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T 細(xì)胞、CD3+CD8+T 細(xì)胞、CD3－CD56+NK細(xì)胞、Treg細(xì)胞的比例與治療前比較無明顯變化（P>0.05）。 （見表 2）

表2 TACE前后患者外周血淋巴細(xì)胞亞群變化

2.2 DC-CIK細(xì)胞回輸前檢測細(xì)胞表型

治療組患者DC-CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)11 d，回輸前取樣本流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型，結(jié)果顯示CD3+CD8+T細(xì)胞比例大大增加，甚至達(dá)到80%以上。（見圖1）錐蟲藍(lán)染色法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞數(shù)量均能達(dá)到109以上。

圖1 細(xì)胞回輸前流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型

2.3 治療組患者治療前后T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞變化

治療組患者開始治療前及DC-CIK細(xì)胞回輸2次后1個月復(fù)查時抽外周血檢測T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞，結(jié)果顯示CD3+CD8+細(xì)胞的比例明顯升高，CD3+CD4+細(xì)胞比例明顯下降，較回輸前差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CD3+細(xì)胞比例較回輸前上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。NK細(xì)胞、Treg細(xì)胞回輸前后比例均無明顯差別，前后比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。 （見表 3）

2.4 兩組患者生存率比較

治療組：隨訪28例，失訪2例，半年生存19例（生存率67.9%），1年生存15例（生存率53.6%）。對照組：隨訪27例，失訪3例，半年生存13例（生存率48.1%），1年生存8例（生存率29.6%）。采用兩獨立樣本生存率的Kaplan-Meier檢驗檢測治療組和對照組半年生存率及一年生存率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療組與對照組生存曲線如圖（見圖2）。

表3 DC-CIK細(xì)胞回輸前后患者外周血T細(xì)胞亞群的變化

圖2 治療組與對照組患者生存曲線圖

3 討論

晚期肝細(xì)胞癌患者因合并肝硬化等基礎(chǔ)疾病、門脈癌栓、肝內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，不適宜進(jìn)行手術(shù)治療。TACE治療晚期肝癌有確切的治療效果，能最大限度保存肝功能，較少導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，已經(jīng)成為此期患者首選的治療措施［4］。但是TACE并不能使腫瘤病灶完全壞死，并且TACE治療會對患者的免疫功能造成損傷，治療后肝癌局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率高［5］。近年來一系列不同的研究證明抗腫瘤免疫與患者預(yù)后關(guān)系密切［6］。加強肝癌局部及全身抗腫瘤免疫反應(yīng)可降低肝癌治療后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，改善患者的預(yù)后［7］。因此將TACE聯(lián)合腫瘤免疫治療是目前肝癌治療研究的重要內(nèi)容。

DC細(xì)胞，是人體最強的抗原提呈細(xì)胞。肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)免疫功能通常處于抑制狀態(tài)，DC細(xì)胞成熟分化障礙，功能缺陷，不能有效提呈抗原，不能使T淋巴細(xì)胞激活，造成肝癌患者抗腫瘤免疫低下［8］。DC-CIK細(xì)胞生物治療指DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)。體外應(yīng)用各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC細(xì)胞分化成熟，糾正腫瘤患者體內(nèi)DC細(xì)胞功能低下、抗原提呈功能缺陷的特點，并以腫瘤抗原刺激DC細(xì)胞使其致敏，再與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)。DC細(xì)胞提呈腫瘤抗原使CIK細(xì)胞活化，回輸體內(nèi)后能識別腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮特異性殺傷作用［9］。CD3+CD8+表型為活化T細(xì)胞表型［10］。本研究證實，DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例明顯上升，說明DC-CIK細(xì)胞中抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞比例大大增加。有文獻(xiàn)報道作為輔助治療，DC-CIK細(xì)胞治療在多種腫瘤中與其他治療方式聯(lián)合，清除殘余癌細(xì)胞，改善患者治療后免疫功能，提高患者長期生存率［11］。

外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量及亞群比例均與免疫功能有關(guān)。腫瘤患者外周血常出現(xiàn)淋巴細(xì)胞數(shù)量及亞群比例異常，如淋巴細(xì)胞數(shù)量下降及CD3+CD8+T細(xì)胞比例下降等免疫功能抑制的表現(xiàn)［12］。另外Treg比例升高也是腫瘤患者免疫抑制的一個重要機制［13］。本研究中TACE術(shù)后外周血淋巴細(xì)胞總體數(shù)量顯著下降（P＜0.01），各亞群比例無明顯變化（P>0.05），提示TACE治療對腫瘤患者免疫功能造成損傷，這種免疫功能的損傷可能是由于術(shù)中應(yīng)用化療藥物，其非特異性細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致。實驗組患者TACE聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞回輸治療后，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例明顯上升、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.05），CD3+T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞及 Treg細(xì)胞比例均無明顯變化（P>0.05）。證明患者聯(lián)合治療后，機體抗腫瘤免疫功能顯著增強。聯(lián)合治療組患者半年、1年生存率明顯高于對照組（P＜0.05），證明聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞對控制腫瘤進(jìn)展發(fā)揮了重要作用。

TACE常見不良反應(yīng)為惡心、嘔吐及發(fā)熱等，患者精神、食欲、睡眠等一般情況較差。治療組患者細(xì)胞回輸后一般情況好轉(zhuǎn)，回輸后不良反應(yīng)僅表現(xiàn)回輸當(dāng)天部分患者出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)，因此聯(lián)合DC-CIK治療安全可靠。肝動脈化療栓塞術(shù)聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞輸注治療晚期肝細(xì)胞癌患者，提高肝癌患者機體的免疫力，控制了腫瘤的生長，改善患者的生活質(zhì)量，延長患者生存期，是晚期肝細(xì)胞癌的一種有效治療方法。

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