王偉昱， 秦漢林， 朱先海， 周 磊， 武樂斌

肝癌是目前最常見的惡性腫瘤之一［1］。125I粒子組織間植入治療原發(fā)性肝癌逐漸得到臨床認(rèn)可并推廣。但其治療肝癌的機(jī)制目前報(bào)道較少。Bcl-2及Bax是目前研究最多的凋亡相關(guān)基因，VEGF是目前所知最強(qiáng)的促血管生成因子。本研究主要采用分子生物學(xué)技術(shù)觀察不同活度125I粒子組織間植入對肝癌細(xì)胞Bcl-2、Bax、VEGF基因 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，探討125I粒子組織間植入殺傷肝癌細(xì)胞的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 兔VX2肝癌模型制作

選取成年健康新西蘭白兔36只，體重2～3 kg，平均體重（2.5±0.32）kg，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。采用VX2肝癌細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集細(xì)胞混懸液注射到新西蘭大耳白兔雙側(cè)后肢皮下，建立荷瘤動物移植瘤種兔模型。2周后將荷瘤種兔處死，取出腫瘤灶并選取腫瘤組織中有活性部分，CT導(dǎo)引下以VX2腫瘤組織塊接種法制備兔VX2肝移植瘤模型。觀察瘤兔生活狀況并定期復(fù)查CT觀察腫瘤生長情況。根據(jù)CT掃描圖像中腫瘤長短徑大小計(jì)算出腫瘤體積（腫瘤體積V=1/2 a×b2，其中a為病灶長徑，b為病灶短徑）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及125I粒子植入

選取荷瘤兔體重及肝腫瘤體積大小無明顯差異的VX2肝癌模型24只，隨機(jī)分為3組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前采用治療計(jì)劃系統(tǒng) （TPS）（北京航空航天大學(xué)、中國原子能科學(xué)研究所和北京原博創(chuàng)新高科技有限公司聯(lián)合研發(fā)）制定合適的治療計(jì)劃［2-3］。按照治療計(jì)劃，CT導(dǎo)引下用粒子植入器予以3組實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头謩e植入初始活度為0 mCi、0.7 mCi及1.0 mCi的125I粒子。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

由于125I粒子半衰期為59.6 d，考慮到時(shí)間過短，125I粒子尚未引起腫瘤組織細(xì)胞大面積凋亡，我們選擇在125I粒子植入術(shù)后第5周處死實(shí)驗(yàn)兔。取出腫瘤病灶，測量病灶重量，采用流式細(xì)胞儀檢測125I粒子植入對兔VX2肝癌細(xì)胞凋亡的影響；采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分別檢測125I粒子植入對腫瘤細(xì)胞凋亡與生長高度相關(guān)基因VEGF、Bcl-2、Bax基因mRNA表達(dá)的影響，計(jì)算實(shí)時(shí)2-△Ct值；提取腫瘤組織蛋白后進(jìn)行蛋白定量分析，采用免疫印跡法測定125I粒子近距離植入對VEGF、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響；采用半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-3活性檢測試劑盒分別檢測腫瘤組織裂解液中caspase-3酶活性變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組均值比較用t檢驗(yàn)，組間差異用ANOVA、Dunnett檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 125I粒子對兔VX2肝癌細(xì)胞凋亡的影響

125I粒子植入4周后，兩實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡率與對照組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與0.7 mCi125I粒子治療組相比，1.0 mCi組對VX2肝癌細(xì)胞凋亡的影響更加明顯（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 125I粒子對兔VX2肝癌細(xì)胞凋亡的影響

2.2 125I粒子對兔VX2肝癌組織中VEGF、Bcl-2和Bax基因mRNA表達(dá)的影響

125I粒子植入后，腫瘤凋亡相關(guān)基因可發(fā)生顯著改變。各組腫瘤組織中 VEGF、Bcl-2、Bax基因mRNA表達(dá)情況見圖2。RT-PCR檢測VEGF結(jié)果見圖3。

2.3 125I粒子對兔VX2肝癌組織中VEGF、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

不同初始活度125I粒子植入治療均可使VEGF、Bcl-2蛋白下調(diào)及Bax蛋白上調(diào)（圖4）。

圖2 125I粒子植入治療對兔VX2肝癌組織中凋亡與生長相關(guān)基因的影響

圖3 RT-PCR檢測VEGF曲線圖

圖4 125I粒子植入治療對兔VX2肝癌組織中凋亡與生長相關(guān)蛋白的影響

2.4 125I粒子對兔VX2肝癌組織caspase-3活性的影響

不同初始活度125I粒子植入兔VX2肝癌模型4周后，caspase-3活性顯著增加，兩治療組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 mCi組與0.7 mCi組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

3.1 125I粒子植入誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

國外一些學(xué)者及國內(nèi)少數(shù)學(xué)者認(rèn)為125I粒子組織間植入后，在近距離放療作用下，腫瘤細(xì)胞死亡的主要形式為凋亡［4］。有研究對早期前列腺癌患者施行CT導(dǎo)引下125I粒子植入腫瘤組織內(nèi)近距離照射治療，治療前、后隨訪中通過活檢檢測腫瘤組織變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞明顯增加，凋亡指數(shù)明顯增加，說明125I粒子近距離照射治療腫瘤，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。我們將不同初始活度125I粒子植入兔VX2移植瘤中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞早期凋亡率逐漸上升，1.0 mCi125I粒子植入組對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響更加明顯，說明125I粒子植入治療對兔VX2移植瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用具有劑量依賴性，并再次證明了125I粒子的抗腫瘤機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是凋亡和抗凋亡失衡調(diào)節(jié)的過程，其中Bcl-2、Bax作為Bcl-2家族中典型的抗凋亡成員和促凋亡成員日益受到關(guān)注。Bcl-2主要發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，因此在腫瘤發(fā)生中，Bcl-2基因及其編碼蛋白具有不同程度的表達(dá)增高。Bcl-2在不同類型腫瘤及不同進(jìn)展期腫瘤中的表達(dá)水平各不相同，通常與腫瘤的惡性程度呈現(xiàn)正相關(guān)［5］。Bcl-2過度表達(dá)，抑制促凋亡蛋白，如細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，使凋亡蛋白酶caspases無法激活，活性氧減少，脂質(zhì)過氧化物無法生成，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常，延緩細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖、累積，容易發(fā)生突變或使已發(fā)生突變的基因在異常增殖細(xì)胞內(nèi)積聚，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)展。因此，Bcl-2過度表達(dá)或異常表達(dá)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制［6］。而Bax可以拮抗Bcl-2的作用。Bax可誘導(dǎo)促凋亡蛋白如細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，激活caspase-3，促進(jìn)活性氧生成，促使細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞膜破壞，從而引起細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞正常增殖［7-8］。

本研究通過RT-PCR和免疫印跡分析等從基因和蛋白水平分別對Bcl-2及Bax基因mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，并檢測caspase-3活性變化，結(jié)果表明不同初始活度125I粒子作用于腫瘤后均可使Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)，1.0 mCi125I粒子植入組作用更加明顯，而不同初始活度125I粒子植入均可使Bax mRNA表達(dá)不同程度上調(diào)，1.0 mCi125I粒子植入組作用更加明顯，從表達(dá)的蛋白水平分析得到類似結(jié)果；對caspase-3活性研究證實(shí)，不同初始活度125I粒子植入均可顯著增加腫瘤組織組織中caspase-3活性，但兩治療組相比無顯著性差異。以上結(jié)果說明，不同初始活度125I粒子植入治療通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期使之阻滯在G2/M期、調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax基因及其表達(dá)發(fā)揮凋亡作用，同時(shí)使caspase-3活性增加，但caspase-3活性并不隨125I粒子劑量增加而增加。本研究進(jìn)一步證實(shí)125I粒子組織間植入治療腫瘤的機(jī)制主要在于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，即通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax表達(dá)，最終激活凋亡執(zhí)行者caspase-3，且125I粒子活度越高，誘導(dǎo)凋亡效果越明顯。

3.2 125I粒子植入抑制腫瘤血管生成

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與細(xì)胞分化、增殖有關(guān)，而且依賴于新生血管的形成［9］。VEGF是目前所知作用最強(qiáng)的促進(jìn)血管形成因子，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管生成，調(diào)節(jié)血管發(fā)展，通過結(jié)合到受體生成血管和淋巴管［10］。VEGF還能夠通過保護(hù)腫瘤血管不受放療介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用降低腫瘤血管的放療敏感性［11］。VEGF表達(dá)及分泌增加可見于多種腫瘤，它對于判斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有重要意義［12］。大量研究表明，抑制VEGF活性能顯著抑制腫瘤的生長［13］。本研究通過RT-PCR和免疫印跡分析等從基因和蛋白水平對VEGF進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，不同初始活度125I粒子植入治療均可使VEGF mRNA表達(dá)下調(diào)，而對照組VEGF呈高表達(dá)，兩者有明顯差異；我們認(rèn)為對照組VEGF水平升高是由于腫瘤負(fù)荷大，腫瘤細(xì)胞增生導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞自分泌所致，兩治療組VEGF mRNA表達(dá)水平均降低，說明不同初始活度125I粒子均能通過產(chǎn)生低劑量率射線降低VEGF mRNA表達(dá)，破壞腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制腫瘤新生血管生成，有效抑制了腫瘤組織生長［14］。我們認(rèn)為125I粒子通過抑制腫瘤新生血管生成殺傷腫瘤細(xì)胞，可能與以下因素有關(guān)：①125I粒子持續(xù)低劑量照射降低了血管內(nèi)皮細(xì)胞亞致死性損傷修復(fù)，提高了殺傷腫瘤效果；②125I粒子通過抑制VEGF表達(dá)，降低了其對腫瘤血管的放射抵抗作用，從而促進(jìn)射線對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用；③125I粒子可通過抑制血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)阻礙腫瘤血管生成；④殺傷腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞減少了腫瘤微血管生成，從而減少腫瘤血供及轉(zhuǎn)移途徑，達(dá)到殺滅腫瘤的目的。本組兩治療組組間比較顯示VEGF表達(dá)水平無顯著性差異，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］，說明兔VX2肝癌細(xì)胞及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞對不同活度的125I粒子釋放的低劑量射線均敏感，其對VEGF表達(dá)水平的影響與125I粒子初始活度無明顯相關(guān)性。

［1]Parkin DM,Bary F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002［J］.CA Cancer JClin,2005,55:74-108.

［2]王忠敏，黃 鋼，陳克敏，等．放射性粒子組織間植入治療技術(shù)指南的建議［J］．介入放射學(xué)雜志， 2009， 18： 641-644．

［3]張景俊，首 峰，李杰慧，等．125I粒子植入治療肝臟邊緣惡性腫瘤的臨床應(yīng)用［J］．介入放射學(xué)雜志，2010，19：878-881．

［4]Dong S,Tang Q,Long M,et al.The cooperative effect of p53 and Rb in local nanotherapy in a rabbit VX2 model of hepatocellular carcinoma［J］.Int JNanomedicine,2013,8:3757-3768.

［5]Lu KV,Chang JP,Parachoniak CA,et al.VEGF inhibits tumor cell invasion and mesenchymal transition through a Met/VEGFR2 complex［J］.Cancer Cell,2012,22:21-35.

［6]Aggarvval S,Devaraja K,Sharma SC,et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in patients with oral squamous cell carcinoma and its clinical significance［J］.Clin Chim Acta,2014,436:35-40.

［7]Li M,Wang ZY,Xing Y,et al.A multicenter study on expressions of vascular endothelial growth factor，matrix metallopeptidase-9 and tissueinhibitor of metalloproteinase-2 in oral and maxillofacial squamous cell carcinoma［J］.Iran Red Crescent Med J,2014,16:1804-1812.

［8]Shi F,Zhang XS,Wu KT,et al.Metastatic malignant melanoma：computed tomography-guided I-125 seed implantation treatment［J］.Melanoma Res,2014,24:137-143.

［9]Beydoun N,Bucci JA,Chin YS,et al.Iodine-125 thin seeds decrease prostate swelling during transperineal interstitial permanent prostate brachytherapy［J］.J Med Imaging Radiat Oncol,2014,58:109-116.

［10]Chen M,He MY,Song YJ,et al.The cytoprotective role of gemcitabine-induced autophagy associated with apoptosis inhibition in triple-negative MDA-MB-231 breast cancer cells ［J］.Int JMol Med,2014,34:276-282.

［11]Wang J,Taylor A,Showeil R,et al.Expression profiling and significance of VEGF-A,VEGFR2,VEGFR3 and related proteins in endometrial carcinoma［J］.Cytokine,2014,68:94-100.

［12]Mittal K,Koon H,Elson P,et al.Dual VEGF/VEGFR inhibition in advanced solid malignancies Clinical effects and pharmacodynamic biomarkers［J］.Cancer Biol Ther,2014,15:975-981.

［13]Nakade J,Takeuchi S,Nakagawa T,et al.Triple inhibition of EGFR,Met,and VEGF suppresses regrowth of HGF-triggered,erlotinib-resistant lung cancer harboring an EGFR mutation［J］.J Thorac Oncol,2014,9:775-783.

［14]Bamias A,Tzannis K,Papatsoris A,et al.Prognostic significance of cytoreductive nephrectomy in patients with synchronous metastases from renal cell carcinoma treated with first-line sunitinib:A european multiinstitutional study ［J］.Clin Genitourin Cancer,2014,12:373-383.

［15]Leng RB,Zha L,Tang LD.MiR-718 represses VEGF and inhibits ovarian cancer cell progression ［J］.FEBSLett,2014,588:2078-2086.