趙 穎 孫崇然 王宇飛 張 瑩 王曉麗 朱友雙

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，山東 日照276826）

漆酶作為一種環(huán)保型酵素，在有機(jī)物合成、造紙業(yè)廢液的處理及紙漿的漂白等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值［1］。在自然界中，粗毛栓菌是重要的產(chǎn)漆酶 菌 株［2－3］。 前 期 研 究 表 明 粗 毛 栓 菌 Trametes hirsuta lg－9能夠高效合成非典型漆酶，該漆酶表現(xiàn)出比普通漆酶應(yīng)用前景更好的特征，如熱穩(wěn)定性高，最適pH值偏低，能夠在不存在介體的情況下氧化甲基紅和茜素紅等［4－6］。然而，該菌漆酶產(chǎn)量較低，遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)要求，因此，對(duì)其進(jìn)行基因突變改良成為一種必然要求。然而，該菌無(wú)性階段為多核菌絲體，不能形成分生孢子，有性孢子的獲得條件高、周期長(zhǎng)［7］，因此，為單基因型細(xì)胞進(jìn)行菌株的基因突變改良則宜選擇單核的原生質(zhì)體。本文以粗毛栓菌Trametes hirsuta lg－9為出發(fā)菌株，對(duì)原生質(zhì)體的制備方法進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)國(guó)內(nèi)外廣泛采用的紫外誘變方法獲得漆酶高產(chǎn)菌株，為進(jìn)一步構(gòu)建非典型漆酶工程菌提供出發(fā)菌株。

1 材料和方法

1．1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用 Trametes hirsuta lg－9（CGMCC No．2422）為山東大學(xué)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基；PDA液體培養(yǎng)基；液體菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基（液體PDA另加數(shù)十顆直徑為5mm的玻璃球）；上層軟洋菜培養(yǎng)基（馬鈴薯汁20%，葡萄糖0．5%，瓊脂2%，pH自然值）。

試劑：0．8MMgSO4溶液（由pH7．4磷酸緩沖液制備 ）；0．8mol／L Sorbitol溶液（Sorbitol 1．2M，CaCl20．05M，Tris．CC pH 7．5 0．01M）；β－葡聚糖酶（Glucanase solarbio公司）；蝸牛酶（上海源葉生物科技有限公司）；ABTS（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司 ）。

1．2 方法

1．2．1 原生質(zhì)體的制備 將新鮮活化的菌株轉(zhuǎn)接液體菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，30℃，120rpm培養(yǎng)58～60h，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，收集菌絲體，先無(wú)菌水洗滌3次，后0．8M的MgSO4溶液洗滌1次。將菌體均分于6個(gè)無(wú)菌三角瓶中，分別加入以MgSO4溶液為溶劑配置的6種酶解液（1%蝸牛酶溶液；0．5%蝸牛酶＋0．5%β－葡聚糖酶溶液；1%β－葡聚糖酶溶液；2%蝸牛酶溶液；1%蝸牛酶＋1%β－葡聚糖酶溶液；2%β－葡聚糖酶溶液）。酶解液震蕩30℃，120rpm，×40顯微鏡下間斷性觀察原生質(zhì)體的釋放情況。待酶解充分后，加入等體積的Sorbitol溶液。8層紗布過(guò)濾即可得到去除菌絲片段的純化原生質(zhì)體。

1．2．2 原生質(zhì)體的再生及紫外誘變 血球計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體數(shù)量，并用Sorbitol溶液將原生質(zhì)體稀釋到一定濃度，將稀釋的溶液分成6份，以其中以一份進(jìn)行原生質(zhì)體再生實(shí)驗(yàn)，不進(jìn)行紫外照射；其它5份分別進(jìn)行40、50、60、70、80s紫外照射，照射后進(jìn)行10min暗處理。分別取400μL原生質(zhì)體溶液與1ml的上層軟洋菜培養(yǎng)基混合均勻，平鋪于固體PDA平板上，30℃培養(yǎng)5d。根據(jù)PDA平板上單菌落的生成情況計(jì)算原生質(zhì)體再生率及原生質(zhì)體紫外誘變致死率。

再生率（%）＝A／α×100% 致死率（%）＝（A－B）／A×100%

注：A－每份400μL稀釋后原生質(zhì)體溶液在再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)；α－血球計(jì)數(shù)板計(jì)算求得的每份400μL稀釋后溶液中原生質(zhì)體數(shù)；B－每份樣品經(jīng)紫外照射后在再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)。

1．2．3 UV誘變菌株漆酶活性和胞外總蛋白的測(cè)定 選取紫外誘變平板單菌落至PDA固體平板，30℃，培養(yǎng)5d后用無(wú)菌打孔器轉(zhuǎn)接至100ml液體PDA培養(yǎng)基，30℃，120rpm，培養(yǎng)3d后，每隔24h，離心取上清。以Trametes hirsutalg－9為對(duì)照，進(jìn)行粗酶液漆酶活力和總蛋白的測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5d。每個(gè)菌株各做3個(gè)重復(fù)，共完成3次平行實(shí)驗(yàn)。上清總蛋白的測(cè)定使用Folin酚法：取300μL上清，加入4ml 4%NaCO3和0．5ml folin酚溶液37℃靜置60min后測(cè)OD500。漆酶活性測(cè)定是采用ABTS法：將上清適當(dāng)稀釋后取30μL加入2．9ml 0．1M 醋酸緩沖液和75μL 20MABTS溶液，37℃靜置30min后測(cè) OD420［8］。

2 結(jié)果

2．1 原生質(zhì)體制備的酶解條件

酶解液的濃度、配比和酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體制備的重要因素。白腐真菌以混合酶液（1%蝸牛酶＋0．5%β－葡聚糖酶）酶解效果最好，2%蝸牛酶次之，以酶解4h為最佳酶解時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 酶解液的濃度及配比對(duì)原生質(zhì)體形成數(shù)的影響

圖1 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率的影響

2．2 原生質(zhì)體的紫外誘變

將稀釋一定濃度的原生質(zhì)體在發(fā)光穩(wěn)定波長(zhǎng)254nm，15W紫外燈下距離30cm處對(duì)原生質(zhì)體分別進(jìn)行了40、50、60、70、80s的紫外燈照射，照射后分別進(jìn)行10min暗處理，30℃培養(yǎng)5d。根據(jù)PDA平板上單菌落的生成情況計(jì)算原生質(zhì)體紫外誘變致死率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同紫外照射時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響

2．3 誘變菌株的功能檢測(cè)

挑取70s誘變平板上的18個(gè)分離、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單菌落，培養(yǎng)發(fā)酵。發(fā)酵3d后，每隔24h測(cè)定各菌株漆酶活力，同時(shí)，為檢測(cè)誘變對(duì)菌體生長(zhǎng)情況的影響，我們同時(shí)檢測(cè)了上清發(fā)酵液的總蛋白活力，用以監(jiān)測(cè)菌株的生長(zhǎng)狀況。最終以出發(fā)菌株Trametes hirsuta lg－9為對(duì)照從中挑選5株漆酶活力有明顯變化的菌株。對(duì)于誘變的菌株，其遺傳穩(wěn)定性有極其重要的作用，為此將篩選到的誘變菌株進(jìn)行3次連續(xù)傳代培養(yǎng)并進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè)。由表3與圖2結(jié)果最終確定誘變菌株JM－70S3和JM－70S8為漆酶活力提高穩(wěn)定菌株。

表3 誘變菌株漆酶的分泌活性和上清中總蛋白分析

圖2 不同菌株培養(yǎng)第7天漆酶與上清總蛋白的OD值

3 討論

3．1 酶解條件對(duì)原生質(zhì)體的影響

酶解液的濃度及配比是影響原生質(zhì)體制備的重要因素，若酶濃度過(guò)大，酶中常常會(huì)含有對(duì)原生質(zhì)體有害的酶類（例如過(guò)氧化物酶、核糖核酸酶等），伴隨著酶量的持續(xù)增加，雜酶的濃度也會(huì)緊隨之而增加，若酶量達(dá)到一定濃度，勢(shì)必將會(huì)影響原生質(zhì)體的活性。此外，在酶濃度過(guò)大時(shí)，菌體易發(fā)生凝集，使得原生質(zhì)體的生成變得困難［9］。本文結(jié)果顯示：白腐真菌是以混合酶液（1%蝸牛酶＋1%β－葡聚糖酶）酶解效果最好，2%蝸牛酶次之。

隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，粗毛栓菌Trametes hirsuta lg－9細(xì)胞脫壁會(huì)愈加完全，而原生質(zhì)體的再生是以細(xì)胞壁的酶解殘余物作引物，所以酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，必然影響到原生質(zhì)體的再生率。由不同的酶解時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)可得，粗毛栓菌Trametes hirsuta lg－9以混合酶液（1%蝸牛酶＋1%β－葡聚糖酶）酶解時(shí)，原生質(zhì)體數(shù)量在前4個(gè)小時(shí)里，隨著時(shí)間線性增加，第5個(gè)小時(shí)原生質(zhì)體數(shù)量增加速率放緩，酶解4h時(shí)的原生質(zhì)體數(shù)量8×105個(gè)／ml，5h時(shí)為8．2×105個(gè)／ml，而原生質(zhì)體再生率4h時(shí)最高為1．44%，5h時(shí)僅為0．86%，因此，粗毛栓菌Trametes hirsuta lg－9以混合酶液（1%蝸牛酶＋1%β－葡聚糖酶）酶解4h為最佳的酶解時(shí)間。

3．2 原生質(zhì)體紫外誘變條件的確定

通過(guò)表2可得在紫外照射時(shí)間為70s時(shí)，致死率為78．26%，據(jù)有關(guān)報(bào)道可知，誘變的最佳致死率在70%～80%之間［10］，而紫外誘變70s符合實(shí)驗(yàn)要求，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇70s為粗毛栓菌Trametes hirsuta lg－9的紫外誘變時(shí)間。

3．3 漆酶高產(chǎn)誘變菌株的確定

由表3中數(shù)據(jù)可知：出發(fā)菌株lg－9上清總蛋白和JM－70S8與JM－70S3在第3天和第4天時(shí)很接近，而在第5天以后，特別是在第7天時(shí)JM－70S8與JM－70S3的總蛋白比lg－9明顯小很多；第7天時(shí)漆酶的產(chǎn)量JM－70S8為出發(fā)菌株的80．38倍，JM－70S3是39．52倍；而JM－70S8第7天漆酶OD值與上清總蛋白OD值比是出發(fā)菌株的257．24倍，JM－70S3菌株是93．57倍。所以，無(wú)論是單純從漆酶活力比較，還是從漆酶與上清總蛋白比值來(lái)比較，都能很明顯地看出JM－70S8與JM－70S3是經(jīng)過(guò)紫外誘變后突變的漆酶高產(chǎn)白腐真菌菌株。

綜上所述，粗毛栓菌Trametes hirsuta lg－9原生質(zhì)體紫外誘變育種的最佳條件為：菌齡為58h，采用1%蝸牛酶＋1%β－葡聚糖酶（1∶1）混合液，30℃酶解4h，并用0．8M的MgSO4溶液作滲透壓穩(wěn)定劑，原生質(zhì)體再生率為1．44%；通過(guò)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行70s紫外照射，在原生質(zhì)體致死率為78%的條件下，篩選出較出發(fā)菌株漆酶高產(chǎn)菌株JM－70S8與JM－70S3。試驗(yàn)結(jié)果表明：原生質(zhì)體誘變育種技術(shù)跨過(guò)某些菌不能形成分生孢子的瓶頸，可作為單核基因育種的重要手段；并且原生質(zhì)體可以作為單個(gè)細(xì)胞單位而便于控制，并避免后代過(guò)多的分離現(xiàn)象。

接下來(lái)可進(jìn)一步對(duì)高產(chǎn)菌株尤其是JM－70S8進(jìn)行培養(yǎng)研究：一方面，在用傳統(tǒng)的PDA液體培養(yǎng)基探討突變株功能時(shí)，通過(guò)發(fā)酵液上清總蛋白的跟蹤檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基特別是在第5天以后不適合突變菌株JM－70S8與JM－70S3的菌量的生長(zhǎng)，從而可對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化從而將JM－70S8與JM－70S3的漆酶產(chǎn)量進(jìn)一步提高；另一方面，出發(fā)菌株Trametes hirsuta lg－9為非典型漆酶生產(chǎn)菌株，而經(jīng)紫外誘變后漆酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)生的漆酶是否還具有非典型性，需要進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證；再一方面對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行基因分析，找到突變基因，并探討哪些基因的變化引起漆酶活力的提高，從而對(duì)基因穩(wěn)定的非典型漆酶高產(chǎn)菌株進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而得到非典型漆酶高產(chǎn)工程菌株。

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