屈亞威，夏憫馨，劉海峰

寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡的構(gòu)建及其初步應(yīng)用

屈亞威，夏憫馨，劉海峰

目的 為探索胃癌分子成像技術(shù)的新方法，構(gòu)建一套新型靈活的寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)，并用于裸鼠胃癌移植瘤模型熒光成像研究。方法 通過(guò)合理的光路設(shè)計(jì)及光學(xué)組件機(jī)加工，裝配寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)不同濃度的2-DG-750熒光探針進(jìn)行成像，分析系統(tǒng)性能；對(duì)尾靜脈注射100 μl 2-DG-750熒光探針的裸鼠胃癌移植瘤模型進(jìn)行在體熒光成像，對(duì)ROI的像素值和成像圖進(jìn)行分析。結(jié)果 體外成像ROI的像素值與熒光探針濃度存在較好的線性回歸關(guān)系，在2-DG-750劑量為31.3 pmol時(shí)，該系統(tǒng)即可檢測(cè)到熒光信號(hào)，提示該系統(tǒng)靈敏性好；在體成像顯示用該系統(tǒng)聯(lián)合2-DG-750熒光探針觀察到了腫瘤組織的較高熒光信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)論 寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)具有很好的靈敏性，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)白光及熒光的雙模式成像，具有實(shí)現(xiàn)光學(xué)分子成像診斷胃癌的潛在應(yīng)用價(jià)值。

熒光內(nèi)鏡；寬視場(chǎng)；近紅外熒光探針；腫瘤檢測(cè)

胃癌是我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤之一，內(nèi)鏡檢查是發(fā)現(xiàn)胃腸道早期癌的最有效途徑[1]?，F(xiàn)有的白光內(nèi)鏡(white light endoscopy，WLE)對(duì)疾病的診斷依賴(lài)于可視化的形態(tài)學(xué)變化，然而多數(shù)早期胃癌形態(tài)學(xué)特征不明顯，漏診率較高[2]。另外，一些光學(xué)技術(shù)，如自體熒光(autofuorescence imaging, AFI)、色素內(nèi)鏡、富士能電子分光內(nèi)鏡技術(shù)(fuji intelligent color enhancement, FICE)和窄帶成像技術(shù)(narrow band imaging, NBI)，雖然已經(jīng)獲得了比較好的臨床應(yīng)用效果[3-5]，但這些特殊光內(nèi)鏡成像技術(shù)仍難以實(shí)現(xiàn)特異性靶向成像，診斷仍依靠形態(tài)學(xué)改變。為了實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性靶向成像，國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索研發(fā)了多種新型靶向熒光造影劑并在臨床前的實(shí)驗(yàn)中取得了很好的效果，為胃癌光學(xué)分子成像的研究奠定了廣闊的造影劑選擇空間[6，7]。然而，體外熒光成像設(shè)備由于體積較大無(wú)法伸入生物體內(nèi)，只能將靶組織或靶細(xì)胞分離后進(jìn)行離體觀察。為了滿(mǎn)足體內(nèi)活體成像的需求，基于光纖的熒光成像設(shè)備得到了快速發(fā)展[8，9]。本研究介紹了一種新型基于熒光寬視場(chǎng)內(nèi)鏡，并且利用該熒光內(nèi)鏡聯(lián)合2-DG-750靶向熒光探針對(duì)裸鼠胃癌移植瘤模型進(jìn)行了初步的成像研究，為分子成像技術(shù)診斷胃癌探索一種新的設(shè)備與方法。

1 材料與方法

1.1 材料 XenoLight RediJect 2-DG-750探針購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)PerkinElmer公司；BGC-803人胃癌細(xì)胞，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心王錚博士惠贈(zèng)；4～6周齡Balb/c裸鼠購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所；氙燈光源(MAX-303，Asahi Spectra, Torrance, US)、激發(fā)光濾光片(XBPA740，Asahi Spectra，Torrance，US)、發(fā)射光濾光片(FF01-840/12-25，Semrock，Rochester，USA)、背照式低溫制冷CCD相機(jī) (Clara, Andor, Belfast, Northern Ireland)由武警總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；傳像光纖束、傳光光纖束購(gòu)買(mǎi)于南京春輝科技實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 搭建寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡 本套靈活寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)模式見(jiàn)圖1。氙燈光源(a)的波長(zhǎng)范圍是從400～1000 nm，根據(jù)不同的熒光探針?biāo)璧募ぐl(fā)光范圍不同，可旋轉(zhuǎn)氙燈(a)中的濾光系統(tǒng)(f1)至需要的波長(zhǎng)范圍。通過(guò)濾光片(b)過(guò)濾后的激發(fā)光平行地進(jìn)入光傳導(dǎo)通路(c)，并由光傳導(dǎo)通路(c)中的獨(dú)立光纖進(jìn)行傳導(dǎo)。而在成像暗箱(h)中，光傳導(dǎo)通路(c)中的所有光纖被分隔開(kāi)來(lái)，圍在傳像光纖(d)周?chē)?，這樣是利用光的全反射現(xiàn)象，可以大大降低光的衰耗。傳像光纖(d)是由相干光纖束和一個(gè)固定濾光片組成，這種相干光纖束直徑大約1.8 mm，其中約有1000根光纖，在其遠(yuǎn)端末端，圍繞激

發(fā)光纖形成一個(gè)閉路環(huán)，并且在其周?chē)€有固定的鏡片，這樣可以提供寬視場(chǎng)照射。基于熒光的發(fā)射則是由固定濾光片和傳出通路(d)收集。為了擴(kuò)大成像畫(huà)面，在CCD相機(jī)(g)的里面裝上了大小合適的傳感芯片(9.0 mm×6.7 mm)，反射激發(fā)光則由擴(kuò)大系統(tǒng)(d)里的過(guò)濾系統(tǒng)(f2)過(guò)濾。在2-DG-750近紅外實(shí)驗(yàn)中，有一個(gè)寬光譜濾光片(f1)，其主要波長(zhǎng)為740 nm，另一個(gè)發(fā)射光濾光片(f2)，其主要波長(zhǎng)是840 nm。熒光成像圖片則由CCD相機(jī)(g)收集，系統(tǒng)的直徑大約為3 mm。圖2為寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)實(shí)物圖。

1.2.2 寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)性能測(cè)試 2-DG-750用PBS稀釋成6個(gè)不同濃度，放在96孔板中，第一排前3個(gè)孔裝滿(mǎn)蒸餾水作為對(duì)照。該系統(tǒng)末端在96孔板上方大約4 cm處，并用能量大約為2 mW的激發(fā)光照射在一個(gè)半徑為2 cm的圓形區(qū)域。選擇感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)測(cè)量其像素值。

圖1 熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)模式圖

a. 光源, 300 W的氙燈; b. 濾光片; c. 傳導(dǎo)通路; d. 傳像光纖; e. 成像放大系統(tǒng); f. 濾光系統(tǒng)；g. CCD數(shù)碼相機(jī)；h. 成像暗箱

圖2 熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)實(shí)物

1.2.3 寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡聯(lián)合2-DG-750對(duì)裸鼠胃癌移植瘤在體成像探索

1.2.3.1 建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)在上述環(huán)境中培養(yǎng)BGC-803細(xì)胞，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰蛋白酶消化1～2 min，吹打分散細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至3×107/ml，制成PBS細(xì)胞混懸液。隨機(jī)選取2只裸鼠分別于右側(cè)腋下接種0.2 ml PBS細(xì)胞混懸液，待腫瘤長(zhǎng)至0.8～1.0 cm備用。

1.2.3.2 成像前準(zhǔn)備 (1)禁食：荷瘤鼠和正常鼠均禁食12 h；(2)麻醉：異氟烷持續(xù)麻醉，裸鼠四肢無(wú)力，麻醉成功；(3)注射熒光探針：將裸鼠(荷瘤鼠、正常裸鼠)俯臥位固定于動(dòng)物板上，取100 μl RediJect 2-DG-750熒光探針注入鼠尾靜脈。

1.2.3.3 活體熒光分子成像 將2只荷瘤鼠在注射2-DG-750后1、3 h分別進(jìn)行成像，系統(tǒng)對(duì)注射探針后的荷瘤鼠進(jìn)行成像時(shí)，鏡頭離荷瘤鼠4～5 cm，這個(gè)距離是平時(shí)內(nèi)鏡工作時(shí)離黏膜的正常距離。首先在安裝激發(fā)光濾光片(f1)，而未安裝發(fā)射光濾光片(f2)的情況下，捕捉白光成像圖；再者，如之前所述安裝激發(fā)和發(fā)射濾光片，從而獲得近紅外成像圖。

1.2.4 結(jié)果處理 采用FMT軟件進(jìn)行圖像采集和分析。

2 結(jié) 果

2.1 寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)特征測(cè)試 探索過(guò)程中得到該系統(tǒng)對(duì)2-DG-750熒光探針的最低靈敏劑量為31.3 pmol，顯示了其較高的靈敏性。另外，像素值與熒光探針濃度存在較好的線性回歸關(guān)系(圖3)。

2.2 寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡聯(lián)合2-DG-750對(duì)裸鼠胃癌移植瘤的在體成像

2.2.1 建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型 2只裸鼠右側(cè)腋下BGC-803細(xì)胞皮下接種后，均長(zhǎng)出瘤體，后經(jīng)病理證實(shí)為低分化胃腺癌。

2.2.2 活體熒光分子成像 在裸鼠胃癌移植瘤模型中，2-DG-750在移植瘤部位出現(xiàn)濃聚，能產(chǎn)生較強(qiáng)熒光(圖4)。

圖3 寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)特性分析

A. 96孔板中稀釋后不同濃度的2-DG-750的熒光成像圖(曝光時(shí)間3 s)。A1-A3是蒸餾水作為對(duì)照，B1-C3是2-DG-750熒光探針的6個(gè)劑量梯度，依次為：1 nmol，500、250、125 、62.5、31.3 pmol。 B.不同濃度2-DG-750熒光探針相對(duì)應(yīng)像素值與濃度的線性回歸圖，計(jì)算得其線性回歸系數(shù)r=0.998

圖4 寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡聯(lián)合2-DG-750對(duì)裸鼠胃癌移植瘤的熒光成像

3 討 論

隨著光纖的進(jìn)一步改良，近年光纖光學(xué)成像設(shè)備得到了快速發(fā)展。為此，筆者介紹一種自主研發(fā)的光纖靈活寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡，同時(shí)聯(lián)合2-DG-750靶向熒光探針對(duì)裸鼠胃癌皮下移植瘤模型進(jìn)行熒光成像探索，以探討它用于腫瘤檢測(cè)。本熒光內(nèi)鏡系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：(1)直徑大約為3 mm，可以通過(guò)內(nèi)鏡活檢工作鉗道，為今后進(jìn)一步臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)；(2)激發(fā)光纖與傳像光纖采用共軸同心排列方式，較并行排列方式相比激發(fā)光照射部位與傳像光纖圖像采集部位具有更好的一致性，避免了因偏心造成假陽(yáng)性病灶出現(xiàn)的可能；(3)可以根據(jù)需要靈活更換激發(fā)、發(fā)射濾光片；(4)用塑料外殼包繞光纖芯，從而利用光的全反射現(xiàn)象，大大降低光的衰耗，傳像光路不需經(jīng)過(guò)二向色鏡分光，減少了光學(xué)信號(hào)的損失，縮短曝光時(shí)間，減少偽影出現(xiàn)的概率。本研究結(jié)果證明，通過(guò)寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡可以對(duì)胃癌裸鼠模型進(jìn)行熒光分子成像，為胃癌的熒光分子成像探索一種新的設(shè)備與方法。然而，由于缺乏臨床上可用的靶向熒光分子探針，寬視場(chǎng)熒光內(nèi)鏡成像模式目前仍只處于臨床前實(shí)驗(yàn)階段。故本研究團(tuán)隊(duì)今后在致力于優(yōu)化本套系統(tǒng)性能的同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步探索研發(fā)適合臨床應(yīng)用的熒光探針。

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(2014-12-06收稿 2015-02-08修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Seting-up a wide-field fluorescence endoscopic and its preliminary application

Qu Yawei, Xia Minxin, and LIU Haifeng.

Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To setup a new flexible wide-field epi-fluorescence endoscope system, then make a fluorescence imaging for gastric cancer xenograft model in nude mice by this system, so as to setup a new device and method for the diagnosis of gastric cancer molecular imaging techniques. Methods The widefield fluorescence endoscope system was assembledusing the rational optical path and optical components machining. Different concentrations of 2-DG-750 fluorescent probe was used to analyze the performance of the imaging system.By intravenous injection of 100 μl2-DG-750 fluorescent probe into the xenografted tumor model,in vivo fluorescence imaging wasconducted, and ROI pixel values and imaging map were analyzed. Results The ROI pixel values demonstrated that a sensitivity of 31.3 pmoles 2-DG-750 was achieved as well as a good linear response from 1nmole to zero fluorescent probe. Fluorescence imaging indicated that gastrointestinal tumor tissues have an eminent 2-DG-750 uptake yielding a relatively strong fluorescence signal. Conclusions The new flexible wide-field epi-fluorescence endoscope system not only has a good sensitivity, but also can do a dual white and fluorescence imaging, which makes a promise future that optical technique will be applied to the diagnosis of gastric cancer.

fluorescence endoscopy; wide-field; near-infrared fluorescent probe; tumor detection

國(guó)家自然科學(xué)基金(81471700)

屈亞威，碩士，醫(yī)師，E-mail：qyw198553@163.com

100039 北京，武警總醫(yī)院消化科

劉海峰，E-mail：haifengliu333@163.com

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