楊 敏，楊繼濤，楊 晰，張 媛

(甘肅農業(yè)大學理學院,甘肅蘭州 730070)

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食品蛋白質的琥珀?；揎椦芯窟M展

楊 敏，楊繼濤，楊 晰，張 媛

(甘肅農業(yè)大學理學院,甘肅蘭州 730070)

琥珀?；揎検且环N常用的蛋白質結構修飾手段,其通過增加蛋白質分子凈負電荷含量而改變蛋白質結構,從而使蛋白質性質顯著改善。本文綜述了蛋白質的琥珀?；揎棗l件以及修飾后蛋白質主要功能性質的變化程度,為蛋白質改性研究提供參考依據。

蛋白質,琥珀酸酐,琥珀酰化修飾,功能性質

蛋白質的化學修飾技術主要是蛋白質的氨基酸殘基修飾技術,是通過化學試劑對蛋白質肽鏈上的特定活性基團衍生化,使部分肽鍵斷裂或引入各種功能基團,包括對氨基酸殘基的?；⑷ヵ０?、磷酸化、糖基化、共價交聯(lián)、水解以及氧化等。蛋白質肽鏈上的活性基團主要有氨基、羥基、巰基等?；瘜W修飾的本質是通過新基團的引入而改變蛋白質的結構、構象以及凈電荷、疏水性等,從而改善其功能性質,如溶解性、表面性質、吸水性、凝膠性以及熱穩(wěn)定性等[1]。目前,關于食品蛋白質的化學修飾研究報道主要有酰化、磷酸化、脫酰胺、糖基化、烷基化等方面[1],其中,酰化修飾因其顯著的修飾效果而備受關注。

在蛋白質的側鏈引入羧酸基即為蛋白質的酰化修飾,該修飾技術反應條件溫和,修飾程度高,部分?；噭┛娠@著改善蛋白質凈電荷,從而使其部分功能性質發(fā)生較大變化,是目前研究較多的一種化學修飾技術。?；揎棾Ｓ迷噭┯幸宜狒?、琥珀酸酐(丁二酸酐)、丁二酸等,其中琥珀酸酐為最常用試劑,其反應活性高,反應條件溫和,易于控制,反應程度高,改性效果顯著。由于琥珀?；揎椇?琥珀酸以酰胺鍵與蛋白質相連,使得其凈負電荷增加顯著,從而相關性質發(fā)生顯著改變[2]。

1 琥珀?；瘜Φ鞍踪|的修飾機理

蛋白質的琥珀?；磻饕请逆溨械挠H核基團攻擊琥珀酸酐的羰基碳原子,從而誘發(fā)的一類親核取代反應。琥珀酸酐與蛋白質氨基反應原理如下:

圖1 蛋白質的琥珀?；揎棛C理Fig.1 The mechanism of succinylation on proteins

賴氨酸(Lys)ε-氨基具有較低的pK值和較弱的空間位阻,表現(xiàn)出較強的親核能力。脂肪族羥基(蘇氨酸,絲氨酸)和巰基(半胱氨酸)也有一定的親和能力,但不如氨基反應活性高。其他側鏈基團,如酪氨酸(Tyr)的酚羥基及組氨酸的咪唑基均可以參與琥珀?；磻?但?；a物不穩(wěn)定[3]。由于琥珀?；鶐в胸撾姾??；揎椇蟮鞍踪|側鏈凈負電荷增加,分子間靜電斥力增大,位阻效應增強,蛋白質結構伸展,構象發(fā)生變化,因此性質顯著改變。

2 蛋白質琥珀酰化修飾的影響因素

琥珀?；揎棾潭扔绊懼揎椇蟮鞍踪|的功能性質。目前,琥珀?；潭瘸Ｓ玫臏y定方法有茚三酮比色法和鄰苯二甲醛法[2]。琥珀酰化對蛋白質的修飾程度與琥珀酸酐用量密切相關。隨著琥珀酸酐用量的增加,蛋白質?；潭妊杆僭龃?當酸酐用量達到一定程度以后,酰化程度增加緩慢甚至不再變化。當琥珀酸酐用量未過量時,酰化反應主要發(fā)生在ε-氨基上,當絕大多數氨基被?；?羥基和巰基才會被酰化。

由于不同類型蛋白質琥珀?；幕钚曰鶊F含量不同,蛋白質分子結構和結構柔韌性不同,即使在酸酐相同用量的情況下酰化程度也會不同。幾種蛋白質的琥珀?；潭纫姳?。

表1 不同蛋白質的琥珀酰化程度[4-8]Table 1 Degree of succinylation on different proteins[4-8]

也有研究指出,琥珀酸酐和蛋白質質量配比的對數值與?；潭缺憩F(xiàn)為近似線性關系,牛血清白蛋白、酪蛋白和兩種魚蛋白均表現(xiàn)出這樣的特性[9]。

當琥珀酸酐嚴重過量時,琥珀?；揎棾潭瓤筛哌_95%以上。例如,當琥珀酸酐用量是氨基含量的100倍時,溶菌酶?；潭瓤蛇_到99%[10];β-乳球蛋白(β-lg)在琥珀酸酐用量為2.5∶1g/g蛋白質時,酰化程度為93%[11]。由此可見,琥珀酰化修飾程度較高,不同程度修飾產物可通過調節(jié)琥珀酸酐用量而獲得。

蛋白質琥珀酰化修飾過程溫度多為室溫或30～50℃,pH為8～9,反應至pH穩(wěn)定即可,反應條件溫和,易于實現(xiàn)和控制[4,11-12]。

3 琥珀?；揎棇Φ鞍踪|空間結構的影響

琥珀?；揎椇?蛋白質多表現(xiàn)為結構伸展,吲哚基發(fā)色團暴露,三級結構改變,二級結構也會因此受到影響,不同蛋白質結構變化程度具有差異。研究指出,溶菌酶?；?9%時,結構發(fā)生變化,Stokes半徑增大,構象穩(wěn)定性顯著降低,鹽酸胍對其變性程度增加;由于負電荷的增加,其自由能降低[10]。然而,也有人指出,溶菌酶琥珀?；蠖壗Y構變化與溫度有關,室溫下其二級結構與未?；嗨芠13]。β-乳球蛋白(β-lg) 經過琥珀?；揎椇笊彼釤晒鈴姸认陆?最大發(fā)射波長發(fā)生紅移,鹽酸胍和尿素實驗顯示其構象穩(wěn)定性降低,三級結構變化;圓二色光譜(CD)實驗顯示,β-lg琥珀?；螃?螺旋、β-折疊、β-轉角3種有序結構含量降低,無規(guī)結構增加,二級結構發(fā)生變化[11]。

琥珀酰化修飾后,酪蛋白膠束結構被破壞,膠束解離程度隨著?；潭鹊脑黾佣黾?粒徑逐漸減小[3]。酰化修飾后,酪蛋白和牛血清蛋白的二級結構變化不顯著,但三級結構變化,乳清蛋白二級結構由規(guī)則結構向無規(guī)結構轉化[14]。大豆水解蛋白?；揎椇髢仍礋晒庵到档?最大發(fā)射波長紅移,CD測定結果顯示折疊結構減少,轉角和無規(guī)結構增加[6]。葵花籽蛋白琥珀?；揎椇髢仍礋晒庵到档?最大發(fā)射波長紅移,三級結構改變[15]。

β-lg經過琥珀?；揎椇笸ㄟ^ANS熒光實驗測得其疏水性降低[11]。?；揎椇?酪蛋白、牛血清白蛋白、乳清蛋白表面疏水性增加[14]。也有研究指出,表面疏水性與?；潭扔嘘P,當?；潭葹?0%～40%時,琥珀?；Q豆蛋白表面疏水性幾乎不變;當?；潭葹?0%～80%時,表面疏水性降低[16]。大豆水解蛋白在?；潭鹊陀?6.2%時,表面疏水性降低,之后升高,這與電荷密度的增加和蛋白質構象變化有關[6]。隨著?；潭鹊脑黾?油菜籽12S球蛋白的表面疏水性顯著降低[8]。

綜上所述,蛋白質琥珀?；鬅晒鈴姸冉档?最大發(fā)射波長紅移,三級結構發(fā)生變化,二級結構具有由有序轉變?yōu)闊o序的趨勢,結構變化程度與蛋白質本身的結構及酰化程度有關。

4 琥珀?；揎棇Φ鞍踪|功能特性的影響

經過琥珀?；揎椇?由于琥珀酰基的引入,蛋白質電荷、結構發(fā)生變化,從而引起性質改變。

4.1 琥珀?；揎棇Φ鞍踪|溶解性的影響

琥珀?；沟鞍踪|負電荷增加,修飾肽段與水的相互作用增強,蛋白質的溶解性得以改善。然而,蛋白質的溶解性與pH密切相關。琥珀酰化修飾使蛋白質等電點以上溶解性增強,等電點以下有所降低,如扁豆蛋白[4]、黎豆蛋白[17]和巴西堅果核球蛋白[5]。琥珀酰化修飾后,在pH4～11范圍內大豆水解蛋白的溶解性顯著增加[7]。燕麥蛋白經過琥珀?；?0.2∶1g/g蛋白質)修飾后,溶解性在pH為7時增加3.79倍[10]。琥珀酰化修飾使酪蛋白在pH 5和7時溶解性增加,而在pH9時基本不變[18]。

4.2 琥珀酰化修飾對蛋白質乳化性的影響

在油-水界面,蛋白質親脂性基團在油相中定向排列,親水性基團在水相中定向排列,從而降低界面張力,表現(xiàn)出乳化性[19]。蛋白質經過琥珀酰化修飾后,溶解性得到改善,促進了蛋白質在油滴表面形成蛋白層,可以更好地與水相作用以發(fā)揮乳化性[20]。另一方面,琥珀?；沟鞍踪|構象變化,包埋于內部的疏水性基團暴露,增強了蛋白質與油相的相互作用。然而,由于琥珀?；揎椩黾恿说鞍踪|的負電荷,使蛋白質之間的斥力增加,阻礙了蛋白質之間的相互作用,因而不易在油水相界面形成穩(wěn)定性較高的蛋白質膜,從而影響乳化穩(wěn)定性[21],例如,燕麥蛋白經過琥珀?；?0.2∶1g/g蛋白質)修飾后,乳化性提高了3.85倍,乳化穩(wěn)定性僅為?；暗?5%;蠶豆蛋白琥珀?；笕榛钚燥@著提高[22]。

也有研究指出,琥珀?；鞍踪|的乳化性變化與蛋白質濃度及體系pH有關。扁豆蛋白在濃度為4%～6%時,琥珀?；笕榛钚栽黾?而當濃度超出6%時乳化活性反而有所下降[4]。在pH為2時,扁豆蛋白乳化穩(wěn)定性降低,在pH4～10時,由于蛋白質的溶解性顯著增強,乳化穩(wěn)定性增加[4]。巴西堅果核球蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性經過琥珀?；揎椇笤趐H 3時有所降低,在pH>3時均得到改善[5]。黎豆蛋白經琥珀?；揎椇笕榛钚院腿榛€(wěn)定性在pH 4以上均得到改善[17]。

蛋白質經過琥珀?；揎椇笕榛宰兓€與?；潭扔嘘P。例如,酰化程度較低時,大豆水解蛋白的乳化活性降低,之后隨著?；潭鹊脑黾佣龃?酰化后乳化穩(wěn)定性顯著增大[7]。

4.3 琥珀酰化修飾對蛋白質發(fā)泡性的影響

蛋白質發(fā)泡性受到諸多因素的影響,如溶解性、表面疏水性、電荷等。Mirmoghtadaie(等)指出,琥珀?；揎楇m然增加了蛋白質的溶解性,有利于發(fā)泡性的改善,但是,由于蛋白質之間靜電斥力的增加,又使發(fā)泡性得以降低,因此琥珀酰化修飾對發(fā)泡性影響不顯著[21]。扁豆蛋白琥珀酰化后泡沫穩(wěn)定性降低,除了pH 2以外,其他pH條件下發(fā)泡性均增強[4]。豆薯蛋白琥珀酰化后在不同pH下發(fā)泡性和泡沫穩(wěn)定性均降低[23]。由于琥珀酰化修飾后表面疏水性增強,大豆水解蛋白的發(fā)泡性顯著增加,且隨著?；潭仍龃蠖鰪?但泡沫穩(wěn)定性極差[7]。

4.4 琥珀?；揎棇Φ鞍踪|吸水性和吸油性的影響

琥珀酰化修飾使蛋白質連接了帶有負電荷的琥珀?；?琥珀?；c羧基間靜電斥力增加,蛋白質結構展開,使其與水的相互作用增強,吸水性增加[24-26]。蛋白質的吸油性受到蛋白質含量、表面積、疏水性、電荷、形貌等諸多因素的影響,一般歸結為物理誘捕。由于琥珀?；加幸欢臻g體積,因而會使蛋白質體積增大,空隙增大,比表面積增大,因此吸油性增強[17,24,26-29]。燕麥蛋白經琥珀酰化(99%)修飾后吸水性和吸油性分別增加了3.46和1.29倍[21]。巴西堅果核球蛋白琥珀?；揎棾潭葹?5.8%時吸水性提高了2.04倍,吸油性提高了1.89倍;酰化程度為72%時吸水性提高了2.15倍,吸油性提高了2.04倍[5]。可見,琥珀?；蟮鞍踪|的吸水性和吸油性增強。

蛋白質琥珀?；笪耘c吸油性的變化還與?；潭扔嘘P。隨著?；潭鹊脑黾?蛋白質的吸水性增強[5,30]。然而,El-Adawy研究綠豆蛋白時指出,吸水性隨?；潭瘸尸F(xiàn)降低趨勢[26]。Bora研究扁豆蛋白發(fā)現(xiàn),酰化程度對吸水性不產生影響[25]。堅果核球蛋白[5]、煙草蛋白[28]吸油性隨酰化程度的增大而增加,而油菜籽蛋白[27]、大豆水解蛋白[7]吸油性隨著?；潭鹊脑黾佣档?。

由此可見,由于不同蛋白質具有不同結構,琥珀?；揎椇笃湮院臀托愿淖兂潭炔煌?。

4.5 琥珀?；揎棇Φ鞍踪|凝膠性的影響

由于琥珀?；揎椩黾恿说鞍踪|的凈負電荷,因而對其凝膠性影響顯著。研究指出,琥珀酰化修飾使酪蛋白的凝膠性遭到破壞[31],延長了酪蛋白的凝膠時間,降低了凝膠強度[2]。

5 展望

綜上所述,琥珀?；揎椏墒沟鞍踪|負電荷增加,結構發(fā)生變化,從而使其功能性質顯著改善,其變化程度與琥珀?；潭扔嘘P。眾多研究一致認為,蛋白質琥珀酰化修飾后等電點以上溶解性增強,有利于蛋白質功能性質在水溶液中的充分發(fā)揮。食品蛋白質通常是食品中的主要成分,在食品加工過程中經受高溫處理、酸度變化、高壓均質等加工過程。然而,迄今為止,琥珀?；揎椇蟮牡鞍踪|在加工過程中的穩(wěn)定性,如熱穩(wěn)定性、高壓穩(wěn)定性,及其與加工體系中的其他物質之間的相互作用尚不明確,有待進一步研究。

[1]趙新淮,徐紅華,姜毓君. 食品蛋白質-結構、性質與功能[M]. 北京：科學出版社，2009.

[2]Vidal V,Marchesseau S,Lagaude A,et al. Influence of chemical agents on casein interactions in dairy products:chemical modification of milk proteins[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，1998,12(1):7-14.

[3]Vidal V,Marchesseau S,Cuq JL. Physicochemical Properties of Acylated Casein Micelles in Milk[J]. Journal of Food Science,2002,67(1):42-47.

[4]Lawal OS. Functionality of native and succinylated Lablab bean(Lablab purpureus)protein concentrate[J]. Food Hydrocolloids,2005,19(1):63-72.

[5]Ramos CMP,Bora PS. Functionality of Succinylated Brazil Nut(Bertholletia excelsa HBK)Kernel Globulin[J]. Plant Foods for Human Nutrition,2005,60(1):1-6.

[6]Achouri A,Zhang W. Effect of succinylation on the physicochemical properties of soy protein hydrolysate[J]. Food Research International,2001,34(6):507-514.

[7]Achouri A,Zhang W,Shiying X. Enzymatic hydrolysis of soy protein isolate and effect of succinylation on the functional properties of resulting protein hydrolysates[J]. Food Research International,1998,31(9),617-623.

[8]Gruener L,Ismond MAH. Effects of acetylation and succinylation on the physicochemical properties of the canola 12S globulin[J]. Part I Food Chemistry,1997,60(3):357-363.

[9]Hamada M，Nagai T,Kai N,et al. Influence of added amounts of succinic anhydride on the succinylation level for some proteins[J]. Journal of National Fisheries University,1999,46(2),95-99.

[10]Ong HN,Arumugam B,Tayyab S. Succinylation-induced conformational destabilization of lysozyme as studied by guanidine hydrochloride denaturation[J]. J Biochem,2009,146(6):895-904.

[11]Chakraborty J,Das N,Das KP,et al. Loss of structural integrity and hydrophobic ligand binding capacity of acetylated and succinylated bovine β-lactoglobulin[J]. International Dairy Journal,2009,19(1):43-49.

[12]楊敏,梁琪,楊繼濤,等. 牦牛乳酪蛋白膠束琥珀酰化修飾研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(15):200-204.

[13]van der Veen M,Norde W,Stuart M C. Electrostatic interactions in protein adsorption probed by comparing lysozyme and succinylated lysozyme[J]. Colloids Surf B Biointerfaces,2004,35(1):33-40.

[14]Lakkis J,Villota R. Effect of acylation on substructural properties of proteins:a study using fluorescence and circular dichroism[J]. J Agric Food Chem,1992,40(4):553-560.

[15]Venktesh A,Praka V. Total proteins and 11s protein fraction(Helianthinin)of sunflower seed(Helianthus annuus L.)Effect of acetylation and succinylation[J]. Nahrung,1994,38(4):359-368.

[16]Knopfe C,Schwenke KD,Mothes R,et al. Acetylation and succinylation of faba bean legumin:Modification of hydrophobicity and conformation[J]. Nahrung/Food,1998,42(3-4):194-196.

[17]Lawal OS,Adebowale KO. Effect of acetylation and succinylation on solubility profile,water absorption capacity,oil absorption capacity and emulsifying properties of mucuna bean(Mucuna pruriens)protein concentrate[J]. Nahrung/Food,2004,48(2):129-136.

[18]Santos CV,Tomasula PM. Acylation and Solubility of Casein Precipitated by Carbon Dioxide[J]. Journal of Food Science,2000,65(2):227-230.

[19]Lawal OS,Adebowale KO,Adebowale YA. Functional properties of native and chemically modified protein concentrates from bambarra groundnut[J]. Food research international,2007,40(8),1003-1011.

[20]Ponnampalam R,Delisle J,Gagne Y,et al. Functional and nutritional properties of acylated rapeseed proteins[J]. Journal of the American Oil Chemists Society,1990,67(8):531-535.

[21]Mirmoghtadaie L,Kadivar M,Shahedi M. Effects of succinylation and deamidation on functional properties of oat protein isolate[J]. Food Chemistry,2009,114(1):127-131.

[22]Krause JP,Krfigel J,Schwenke KD. Properties of interfacial films formed by succinylated legumin from faba beans(VieiafabaL.)[J]. Colloids Surfaces B:Biointerfaces,1997,8(6):279-286.

[23]Arogundade L A,Eromosele C O,Eromosele I C,et al. Effect of glycosylation via maillard reaction and acylation on African yam bean(Sphenostylis stenocarpa)protein functionality[J]. Food Science and Biotechnology,2013,22(4):951-960.

[24]Zaghloul M,Prakash V. Effect of succinylation on the functional and physicochemical properties of a-globulin,the major protein fraction from Sesamum indicum L[J]. Nahrung/Food,2002,46(5):364-369.

[25]Bora PS. Functional properties of native and succinylated lentil(Lens culinaris)globulins[J]. Food Chemistry,2002,77(2):171-176.

[26]El-Adawy TA. Functional properties and nutritional quality of acetylated and succinylated mung bean protein isolate[J]. Food Chemistry,2000,70(1):83-91.

[27]Dua S,Mahajan A,Mahajan A. Improvement of functional properties of rapeseed(Brassica campestris Var. Toria)preparations by chemical modification[J]. Journal of agricultural and food chemistry,1996,44(3):706-710.

[28]Monteiro PV,Prakash V. Alteration of functional properties of peanut(ArchishipogaeaL.)protein fractions by chemical and enzymatic modification[J]. J Food Sci Technol(India),1996,33:19-26.

[29]Sheen SJ. Effect of succinylation on molecular and functional properties of soluble tobacco leaf proteins[J]. Journal of agricultural and food chemistry,1991,39(6):1070-1074.

[30]Ponnampalam R,Goulet G,Amiot J,et al. Some functional properties of acetylated and succinylated oat protein concentrates and a blend of succinylated oat protein and whey protein concentrates[J]. Food chemistry,1988,29(2):109-118.

[31]Lieske B,Konrad G,Faber W. Effect of succinylation on the renneting properties of raw milk[J]. Milchwissenschaft,2000,55(2):71-74.

Review on succinylated modification of food proteins

YANG Min，YANG Ji-tao，YAN Xi，ZHANG Yuan

(College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Succinylation is one of the modification method of protein,which increase the net charge of protein and change its structure,resulting in improvement of its functional properties. In this paper,the reaction condition,level of succinylation and change of functional properties of protein were reviewed. It would provide the references for protein modification.

protein;succinic anhydride;succinylated modification;functional properties

2014-06-10

楊敏(1981-)，女，在讀博士，講師，研究方向：乳品科學與技術。

TS201.2

A

1002-0306(2015)05-0396-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.076