紀(jì)懿芳,胡文忠,姜愛(ài)麗,馮 可,董 妍

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

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海產(chǎn)品中副溶血弧菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展

紀(jì)懿芳1,胡文忠2,*,姜愛(ài)麗2,馮 可3,董 妍1

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

副溶血弧菌是主要的食源性致病菌之一,主要存在于魚(yú)蝦貝等海產(chǎn)品中。人們?cè)谑秤帽桓比苎【腥镜暮．a(chǎn)品時(shí),容易出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、腹痛等急性腸胃炎癥狀。本文主要介紹了副溶血弧菌的分子生物學(xué)、免疫學(xué)等幾種快速檢測(cè)方法,并對(duì)未來(lái)的發(fā)展前景做了展望。

副溶血弧菌,檢測(cè)方法

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,簡(jiǎn)稱(chēng)VP),是一種主要的食源性致病菌,嗜鹽的革蘭氏陰性細(xì)菌,屬弧菌科弧菌屬,廣泛分布于沿海、河口環(huán)境和魚(yú)、蝦、貝等海產(chǎn)品中。近年來(lái),全球所有已被確診的腹瀉性腸胃炎病例中,有50%～70%的感染者是由于食用未煮熟的海產(chǎn)品而導(dǎo)致的[1]。在我國(guó),副溶血弧菌引起的食物中毒在所有的細(xì)菌性腸胃炎中占有較高的比重,危害較大。在中國(guó)報(bào)道的食物中毒病例中,由副溶血弧菌引起的病例占了31.1%。傳統(tǒng)的副溶血弧菌的檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng),操作繁瑣,靈敏度低。因此,開(kāi)發(fā)采用精確先進(jìn)的生物化學(xué)方法,快速的檢測(cè)副溶血性弧菌,提高食品的安全性,確保人民生命安全,減少財(cái)產(chǎn)損失顯得尤為重要。

1 細(xì)菌培養(yǎng)法

近幾年在原有標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上形成了許多的新技術(shù),以提高檢測(cè)效率特別是縮短檢測(cè)時(shí)間,包括國(guó)標(biāo)分離培養(yǎng)結(jié)合API方法鑒定、選擇性培養(yǎng)基等。沈玄藝[2]等人按國(guó)標(biāo)方法從食品中分離2株弧菌,用Vitek-32型細(xì)菌鑒定儀和API-20E生化試劑鑒定分析,結(jié)果符合副溶血弧菌特征,生化結(jié)果與參考標(biāo)準(zhǔn)株ATCC18072和病人分離株的副溶血弧菌一致,可定為產(chǎn)色素的副溶血弧菌。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便用時(shí)短,API實(shí)驗(yàn)僅用18～24h即可完成生化鑒定。盧勉飛[3]等人開(kāi)發(fā)出一種副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基(HKMVPM),顯色培養(yǎng)基上副溶血性弧菌菌落均呈現(xiàn)特異性的品紅色,而非副溶血弧菌則表現(xiàn)為藍(lán)綠色、無(wú)色等現(xiàn)象。與國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品相比,分離率高低順序?yàn)?HKMVPM>KHVPM>TCBS。顯色培養(yǎng)基具有操作簡(jiǎn)單、高檢出率及高特異性的特點(diǎn),可進(jìn)一步優(yōu)化配方來(lái)增加顏色變化的敏感性和特異性使其擁有更良好的應(yīng)用前景。

2 分子生物學(xué)方法

2.1 普通PCR

PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR),是Mulis[4]在1985年發(fā)明的一種體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的技術(shù),具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)。李青[5]等人對(duì)副溶血弧菌的不耐熱溶血毒素tlh基因設(shè)計(jì)特異性引物,純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度為1.0cfu/mL,人工污染樣品檢出率為100%。黃晨陽(yáng)[6]等人根據(jù)副溶血弧菌的toxR基因設(shè)計(jì)特異性引物,建立優(yōu)化PCR反應(yīng)體系,提高靈敏度,檢出限達(dá)到4×103cfu/mL。PCR操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,但是容易被其他雜質(zhì)和DNA污染而出現(xiàn)假陰性或者假陽(yáng)性的結(jié)果,在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí),可以通過(guò)添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)、降低退火溫度、對(duì)引物進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)等方法來(lái)排除假陰性。此外,PCR操作不可以區(qū)分活/死菌和沒(méi)有毒力的致病菌而產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果,可以添加疊氮溴化丙錠等DNA染料降低假陽(yáng)性率。傳統(tǒng)PCR技術(shù)在靈敏度、特異性、儀器自動(dòng)化程度和實(shí)驗(yàn)成本都有一定的局限性,所以在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)了許多PCR改進(jìn)技術(shù),如多重PCR、熒光定量PCR、巢式PCR等,從不同方面彌補(bǔ)傳統(tǒng)PCR的不足。

2.2 多重PCR

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-PCR)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence qualitative PCR),在基礎(chǔ)的PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),通過(guò)檢測(cè)熒光量來(lái)測(cè)定樣本的核酸量。熒光PCR具有高靈敏性和特異性,實(shí)驗(yàn)在封閉體系中完成,減少了污染的可能性,并可做到定性和定量分析等特點(diǎn)[10-11]。Garrido[12]等人分別從海水和海產(chǎn)品中分離得到副溶血弧菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn),用多重?zé)晒舛縋CR同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌的tdh和trh基因,tdh、trh1和trh2的檢出限分別為26、11和8cfu/25g,此方法與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法相比時(shí)間可以縮短1/3。Blackstone[13]針對(duì)副溶血弧菌的tdh基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR,同時(shí)檢測(cè)13株非副溶血弧菌細(xì)菌,只有副溶血弧菌的tdh基因顯熒光。同時(shí)用AWM堿性蛋白胨水富集牡蠣中的副溶血弧菌結(jié)合實(shí)時(shí)PCR,24h內(nèi)可以檢測(cè)61份樣品,比普通的平板劃線富集法檢測(cè)多4倍。林強(qiáng)[14]等人以副溶血弧菌的毒素調(diào)控基因toxR,設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan探針。用熒光定量PCR方法對(duì)含toxR基因質(zhì)粒、純培養(yǎng)物和人工污染的牡蠣樣品進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn),靈敏度分別為15拷貝、18cfu/mL和180cfu/mL,多次重復(fù)變異系數(shù)在1%左右。熒光定量PCR探針成本高、設(shè)計(jì)難,在實(shí)驗(yàn)中我們要確保引物的特異性和條件的最優(yōu)化。TaqMan和分子信標(biāo)熒光探針是熒光定量PCR的檢測(cè)主流,隨著探針技術(shù)的發(fā)展,出現(xiàn)更穩(wěn)定更特異的探針,如可以快速產(chǎn)生信號(hào)的Scorpion探針和設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、成本低、特異性可靈活改變的雙鏈探針,此外還有cycling探針、Simple探針和神標(biāo)熒光探針。同時(shí),數(shù)據(jù)軟件的更新改進(jìn),與其它技術(shù)連用和更靈敏的熒光標(biāo)記材料的不斷出,將是此技術(shù)未來(lái)發(fā)展的主流趨勢(shì)。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi[15]等在2000年開(kāi)發(fā)的一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法,Lamp技術(shù)是在恒定的溫度下,針對(duì)靶基因上的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物,在DNA聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。Lamp在恒定溫度下,不到1h就能達(dá)到109～1010倍的擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng),靈敏度高,操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒病原體、真菌病原體檢測(cè)等方面[16-17]。金雪花[18]等人針對(duì)副溶血性弧菌tlh基因用EMA-LAMP法檢測(cè)、鑒別副溶血弧菌死/活細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)得出抑制細(xì)菌死細(xì)胞LAMP擴(kuò)增的EMA最小濃度為8.0μg/mL。EMA-LAMP方法檢測(cè)副溶血的檢出限為1.0×102cfu/mL。實(shí)驗(yàn)可以有效的檢測(cè)出副溶血弧菌的死/活細(xì)胞。但實(shí)驗(yàn)中EMA達(dá)到一定濃度時(shí)也會(huì)對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用,因此實(shí)驗(yàn)中要注意EMA的用量,同時(shí)還要控制溫度和曝光時(shí)間。Yamazaki[19]等人檢驗(yàn)171份海產(chǎn)品樣品副溶血弧菌污染情況,利用堿性蛋白胨富集海產(chǎn)品中的副溶血弧菌,針對(duì)副溶血弧菌的tlh基因設(shè)計(jì)特異性引物。結(jié)果表明lamp方法靈敏度和特異性分別達(dá)到100%和90.8%,比傳統(tǒng)方法檢出率更高,適用性更強(qiáng)。Prompamorn[20]等人應(yīng)用LAMP-LFD方法快速檢測(cè)副溶血弧菌,用LAMP方法結(jié)合FITE核酸檢測(cè)側(cè)向?qū)游鲈嚰?對(duì)副溶血的tlh基因設(shè)計(jì)引物。純培養(yǎng)物靈敏度為120 cfu/mL,比常規(guī)PCR檢出限少一個(gè)數(shù)量級(jí)。LAMP技術(shù)不需要特殊的儀器,適用于現(xiàn)場(chǎng)操作,但實(shí)驗(yàn)在常溫下進(jìn)行,操作時(shí)容易被污染,同時(shí)食品中的鈣離子和血液等也會(huì)影響鑒定結(jié)果,可通過(guò)精細(xì)處理樣品、操作時(shí)避免氣溶膠產(chǎn)生、分裝試劑、加熱、添加Sybr greenI染色劑等方法提高準(zhǔn)確性減少假陰性。LAMP結(jié)果可以通過(guò)肉眼觀察沉淀,但是并不是特別明顯,現(xiàn)多在反應(yīng)前后添加指示劑來(lái)判斷反應(yīng)結(jié)果,已有Sybr greenI、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)和羅丹明 B 衍生物等指示劑。

2.5 原位熒光恒溫核酸擴(kuò)增方法(In Situ LAMP)

原位熒光恒溫核酸擴(kuò)增方法(fluorescence in situ loop-mediated isothermal amplification),結(jié)合了原位雜交和LAMP技術(shù),可以檢測(cè)單拷貝基因,省略提取DNA等步驟,反應(yīng)溫度低,結(jié)果較易觀察[21]。Fumito[22]等人首先將該技術(shù)用于大腸桿菌O157∶H7的定性和定量檢測(cè)中。Wang[23]等人應(yīng)用原位熒光恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的副溶血弧菌,以thl為目的基因設(shè)計(jì)引物,對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌和人工污染樣品進(jìn)行原位熒光擴(kuò)增,使用PCR、LAMP和in suit LAMP方法對(duì)市售水產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。in suit LAMP實(shí)驗(yàn)特異性強(qiáng),可有效檢測(cè)出副溶血弧菌。最低檢出限低于其他檢測(cè)方法,可以達(dá)到檢測(cè)出單個(gè)細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)不受其他雜質(zhì)的影響,人工污染樣品檢出率可以達(dá)到96%以上。但是,in suit LAMP在用于不同細(xì)菌時(shí)候,由于細(xì)菌結(jié)構(gòu)復(fù)雜,在處理細(xì)胞壁通透性時(shí)需要用特異的方法進(jìn)行處理,否則不利于核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行和避免擴(kuò)增后的產(chǎn)物流出。

2.6 基因芯片

基因芯片,又稱(chēng)DNA微陣列(DNA microarray),最早是由Southern[24]在1989年提出的。基因芯片是把大量已知序列基因探針有序的、高密度的集成在同一玻片上,經(jīng)過(guò)標(biāo)記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交,通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào),對(duì)生物細(xì)胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析[25]。韓海紅[26]等人研制副溶血弧菌全基因組芯片,挑選出4770條基因,對(duì)各基因經(jīng)行PCR擴(kuò)增,點(diǎn)樣法制備芯片,經(jīng)PCR法確定準(zhǔn)確性,成功的研制了一批質(zhì)量良好的副溶血弧菌全基因組DNA芯片。王軍[27]等人根據(jù)臨床疾病表現(xiàn)的特點(diǎn)進(jìn)行組合,設(shè)計(jì)特異性引物及探針,制備DNA芯片,運(yùn)用多重PCR和基因芯片技術(shù)一次檢測(cè)腹瀉病糞便同一標(biāo)本中7種常見(jiàn)致病菌。64份樣本中檢測(cè)出45份致病菌,其中12份為副溶血弧菌,副溶血弧菌檢出限最低達(dá)到10cfu/mL?；蛐酒瑥?0世紀(jì)90年代發(fā)展至今,尤其高通量、檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、有多色熒光標(biāo)記、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)在生物研究領(lǐng)域發(fā)揮重大作用。但是該技術(shù)也存在一些問(wèn)題,制作成本高,芯片的制作和檢測(cè)都需要價(jià)格高傲的設(shè)備和復(fù)雜的制作過(guò)程,對(duì)致病微生物基因序列信息的匱乏,芯片的質(zhì)量等。未來(lái)基因芯片將沿著提高探針陣列的集成度和穩(wěn)定性,降低成本,與其它技術(shù)結(jié)合使用,和生物信息學(xué)聯(lián)合發(fā)展等方向,將此技術(shù)擴(kuò)展到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域,成為在商業(yè)化快速檢測(cè)重要手段。

3 免疫學(xué)檢測(cè)方法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法

ELISA具有特異性強(qiáng)、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、低成本、試劑可長(zhǎng)時(shí)間保存、無(wú)放射性同位素污染等特點(diǎn)。多被用于病原微生物、轉(zhuǎn)基因食品、農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)[28]。李國(guó)[29]等人從文蛤中分離出副溶血弧菌制備血清,用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗兔血清為酶標(biāo)二抗,對(duì)副溶血進(jìn)行間接ELISA檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果靈敏度較低。何彬斌[30]分離純化抗副溶血弧菌雞卵黃免疫球蛋白建立的間接ELISA方法,一抗的最佳工作質(zhì)量濃度為15lg/mL,二抗的最佳稀釋度為1/10000,副溶血弧菌純培養(yǎng)液的檢出限為1.0×105cfu/mL,實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較強(qiáng)的特異性,能夠確切地對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行檢測(cè)。ELISA 不可避免地存在著一些缺陷,如對(duì)試劑的選擇性高、對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng),分析低分子量或不穩(wěn)定的化合物有一定的困難等,但與其它檢手段聯(lián)合使用,如色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、電化學(xué)方法等,既可增加檢測(cè)的靈敏度又可降低交叉反應(yīng),更準(zhǔn)確地定量。

3.2 免疫膠體金技術(shù)(ICG)

免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold tech-nique),是以膠體金為標(biāo)記物,利用特異性抗原抗體反應(yīng),在光鏡電鏡下對(duì)抗原或抗體物質(zhì)進(jìn)行定位、定性乃至定量研究的標(biāo)記技術(shù)。膠體金制備簡(jiǎn)單、價(jià)低、可用于常規(guī)光鏡和熒光顯微鏡、結(jié)果直觀、可較長(zhǎng)時(shí)間保存、對(duì)儀器要求低等特點(diǎn)[31]。楊靖亞[32]利用雙抗體夾心法開(kāi)發(fā)斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾測(cè)試盒,能準(zhǔn)確的檢測(cè)副溶血弧菌tdh基因,其最低檢測(cè)限達(dá)到250μg/mL。檢測(cè)結(jié)果可在4℃條件下保存12周,其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均未發(fā)生較大的改變。王報(bào)貴[33]等人對(duì)膠體金免疫試紙條進(jìn)行改進(jìn),改進(jìn)后的試紙條具有較好的特異性及靈敏度,在15min內(nèi)就可以完成檢測(cè)。但是,免疫膠體金實(shí)驗(yàn)容易被溫度和雜質(zhì)影響,假陰性率較高?？梢圆捎眯盘?hào)放大系統(tǒng)如生物素-親和素系統(tǒng),在同一膜上作多種項(xiàng)目測(cè)定和多項(xiàng)目的組合測(cè)定,應(yīng)用TROPT檢測(cè)光密度等方法來(lái)提高免疫膠體金檢測(cè)的敏感性、特異性、實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)。

4 利用噬菌體及其在副溶血弧菌快速檢測(cè)中的初步應(yīng)用

Peng[34]等人利用噬菌體的高度專(zhuān)一性特點(diǎn),從副溶血弧菌分離得到噬菌體,找出理想的噬菌體(副溶血弧菌p1)。用副溶血弧菌p1結(jié)合細(xì)菌熒光素酶-FMN和NADH氧化還原酶經(jīng)行體外發(fā)光體系對(duì)副溶血弧菌的定量檢測(cè)。檢測(cè)副溶血弧菌回收率可以達(dá)到95%以上,重復(fù)實(shí)驗(yàn)偏差小于1,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在4.5h之內(nèi)可以完成。該方法準(zhǔn)確度、復(fù)性、精密度和時(shí)短都達(dá)到較高的要求,適用于現(xiàn)代快速檢測(cè)。但是,由于VP菌噬菌體裂解譜均比較窄,應(yīng)用范圍有限,可通過(guò)分子生物學(xué)方法改造噬菌體的基因組,或者通過(guò)將不同裂解譜的噬菌體混合使用,以擴(kuò)大裂解譜的范圍使其更適用于現(xiàn)代化檢測(cè)。

5 變性高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)

變性高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)(denaturing high performance liquid chromatography),是由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合變性高效液相色譜的技術(shù)。廖亮[35]等人利用DHPLC在非變性溫度下進(jìn)行雙鏈DNA分離的原理及DHPLC技術(shù)分析副溶血弧菌特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,檢測(cè)結(jié)果可觀。DHPLC可以多次測(cè)量多個(gè)樣品并可避免單獨(dú)PCR反應(yīng)后期易污染等特點(diǎn)。

6 前景和展望

副溶血弧菌的傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法要經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)的分離、增菌、鏡檢和生化鑒定等繁瑣步驟,現(xiàn)代進(jìn)出口食品中副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法常有實(shí)時(shí)熒光PCR、LAMP和MPCR-DHPLC法等,并結(jié)合傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定。此外目前還有吖啶、橙染色法、高通量微生物鑒定儀、蛋白芯片法和電化學(xué)免疫傳感器等在實(shí)驗(yàn)室使用的檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)代分子生物技術(shù)因快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)已經(jīng)逐步進(jìn)入市場(chǎng)并占有主流地位。但是,每種方法都有自己的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì),各項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)化和搭配使用是我們要在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上努力的方向。如LAMP技術(shù)與生物傳感器技術(shù)相結(jié)合,酶聯(lián)免疫磁珠技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合?；蛐酒夹g(shù)融合了PCR、納米芯片和探針雜交。可以同時(shí)檢測(cè)多種致病菌,達(dá)到高效、準(zhǔn)確等特點(diǎn),適用于現(xiàn)代檢測(cè)快速和高通量的要求,具有廣泛的應(yīng)用空間。

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Advancement of detection techniques forVibrioparahaemolytiousin aquatic products

JI Yi-fang1,HU Wen-zhong2,*,Jiang Ai-li2,FENG Ke3,DONG Yan1

(1.College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

Vibrioparahae-molytiousis one of the most frequent causes of death as food-borne pathogens in food. It infects the seafood products mostly and when people eat the seafood which is contaminated byVibrioParahaemolytcus,it will cause acute gastroenteritis,such as diarrhea,vomiting,abdominal eramps and so on. Molecular biological and immunological methods of the detection forVibrioParahaemolytcusand prospect the development direction of this field were summarized.

V.parahaemolyticus;detection

2014-05-13

紀(jì)懿芳(1989-),女,在讀碩士,研究方向:食品科學(xué)。

*通訊作者:胡文忠(1959-),男,博士，教授,研究方向:食品科學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172009);國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD38B05);大連市金州新區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012-A1-049)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)05-0365-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.069