陳 菲,張奉蘇,劉訓(xùn)紅,楊念云,侯 婭,馬 陽(yáng)

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023)

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樟芝菌粉的氨基酸測(cè)定及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

陳 菲,張奉蘇,劉訓(xùn)紅*,楊念云,侯 婭,馬 陽(yáng)

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023)

建立了柱前衍生化高效液相色譜(HPLC)測(cè)定樟芝菌粉中氨基酸含量的方法,并進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)分析。樣品以鄰苯二甲醛(OPA)為衍生化試劑衍生后進(jìn)行HPLC分析,色譜條件為:Thermo Hypersil GOLD Dim色譜柱(150mm×4.6mm,3μm),流動(dòng)相A為20mmol/L醋酸鈉∶0.3%四氫呋喃∶0.02%三乙胺(pH7.2),流動(dòng)相B為100mmol/L醋酸鈉∶甲醇∶乙腈(200∶450∶350),流速為1mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為338.1nm;采用氨基酸比值系數(shù)法對(duì)樟芝菌粉進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:樟芝菌粉中含有20種游離氨基酸、18種結(jié)合氨基酸,氨基酸的種類和含量豐富;菌粉中除苯丙氨酸+酪氨酸外,其余幾種必需氨基酸均低于WHO/FAO模式譜,氨基酸配比合理性不高,菌粉中第一限制性氨基酸為蛋氨酸+半胱氨酸,樟芝菌粉含有γ-氨基丁酸,含量為1.57mg/g。

樟芝菌粉,氨基酸,柱前衍生高效液相色譜法,營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

樟芝Antrodiacamphorata(M.Zang & C.H. Su)Sheng H. Wu,Ryvarden & T.T. Chang為我國(guó)臺(tái)灣特產(chǎn)真菌,僅生長(zhǎng)于臺(tái)灣保育類樹種——牛樟樹(Cinnamomum kanehirai Hay)上[1]。樟芝具有清熱解毒、清肝瀉火、消癰散結(jié)、利咽、散瘀止痛之功效[2]。目前,樟芝的研究多集中于樟芝發(fā)酵菌絲體。

氨基酸作為生物體內(nèi)構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位,是生物體內(nèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分。食物中氨基酸的含量、種類及比例是評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要指標(biāo)之一。目前氨基酸的分析方法包括氨基酸自動(dòng)分析儀[3],柱前衍生、熒光或紫外檢測(cè)的高效液相色譜(HPLC)法[4-5],毛細(xì)管電泳法等[6],《食品中氨基酸的測(cè)定(GB/T 5009.124-2003)》規(guī)定了用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定食物中16種氨基酸的方法[7]。柱前衍生HPLC法因具有分離度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn),已成為氨基酸分離分析的有力工具[8]。鄰苯二甲醛(OPA)因具有衍生步驟簡(jiǎn)單、反應(yīng)速度快、剩余試劑不干擾測(cè)定等特點(diǎn),而成為一種經(jīng)典的氨基酸衍生試劑。本文在前期研究基礎(chǔ)上[9-11],采用柱前衍生化高效液相色譜法分析不同批次、不同培植方法樟芝中游離氨基酸和結(jié)合氨基酸的組成及含量,同時(shí)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)分析,并與靈芝作比較,為樟芝菌粉的開發(fā)利用和品質(zhì)評(píng)價(jià)進(jìn)一步提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品S1～S10為臺(tái)灣長(zhǎng)庚生物科技股份有限公司提供的樟芝發(fā)酵菌粉,批號(hào)為:02L07,02L11,02L14,02L18,02L21,02L25,02L28,03L04,03L07,03L11;S11為臺(tái)灣長(zhǎng)庚生物科技股份有限公司提供的椴木栽培樟芝子實(shí)體;S12為收集于安徽亳州藥材市場(chǎng)的靈芝(紫芝);天門冬氨酸(Asp,1)、谷氨酸(Glu,2)、絲氨酸(Ser,3)、組氨酸(His,4)、甘氨酸(Gly,5)、蘇氨酸(Thr,6)、精氨酸(Arg,7)、丙氨酸(Ala,8)、酪氨酸(Tyr,9)、胱氨酸(Cys,10)、纈氨酸(Val,11)、蛋氨酸(Met,12)、苯丙氨酸(Phe,13)、異亮氨酸(Ile,14)、亮氨酸(Leu,15)、賴氨酸(Lys,16)、脯氨酸(Pro,17)、谷氨酰胺(Gln,18)、γ-氨基丁酸(GABA,19)、色氨酸(Trp,20)標(biāo)準(zhǔn)品 Agilent公司,純度≥99%,濃度為1nmol/μL;乙腈 美國(guó)天地公司,色譜純;工業(yè)高純氮 上海比歐西氣體工業(yè)有限公司;鄰苯二甲醛(OPA)、鹽酸、氫氧化鈉等,分析純;實(shí)驗(yàn)用水均為雙重蒸餾水。

Agilent 1200高效液相色譜儀,包括G1315C系列DAD檢測(cè)器 美國(guó)安捷倫;YP601N電子天平 上海精密科學(xué)儀器公司;DHG-9023電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏設(shè)備有限公司;KQ-500B超聲波清洗機(jī) 昆山超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 游離氨基酸供試液的制備 精確稱取S1～S12樣品粉末(100目)干品1g,分別置于安瓿底部,加入6mL 80%乙醇溶液,放置過(guò)夜,次日超聲處理20min,過(guò)濾,樣品再依次用2mL 80%乙醇超聲提取2次,每次10min,濾過(guò),合并3次濾液置10mL容量瓶,加入80%乙醇稀釋至刻度,即得游離氨基酸供試液。

1.2.2 酸水解液的制備 精密稱取上述樣品200mg,分別置于安瓿底部,加入6mol/L HCl(含1%苯酚)2mL,通氮?dú)獠⒀杆俜夤芸?置110℃烘箱中水解24h,取出放冷至室溫。打開管口,加堿中和至pH=7,過(guò)濾,將濾液定量轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中[1],加蒸餾水稀釋至刻度,即得酸水解液。

1.2.3 堿水解液的制備 精確稱取上述干燥樣品200mg,分別置于安瓿底部,加入5mol/L NaOH溶液2mL,通氮?dú)獠⒀杆俜饪?置110℃烘箱中水解24h,取出放冷至室溫。打開管口,加酸中和至pH=7,過(guò)濾,將濾液定量轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,即得堿水解液(用于測(cè)定色氨酸)。

1.2.4 衍生化方法及測(cè)定方法 采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生化方法[12]。色譜柱:Thermo Hypersil GOLD Dim(150mm×4.6mm,3μm);流動(dòng)相A:20mmol/L醋酸鈉∶0.3%四氫呋喃∶0.02%三乙胺(pH7.2);B相:100mmol/L醋酸鈉∶甲醇∶乙腈(200∶450∶350);梯度:0～33min,B相從6升至47%;36～40min,B相到100%;流速:1mL/min;柱溫:40℃;泵壓:15～20Mpa;檢測(cè)波長(zhǎng):338.1nm;進(jìn)樣量1μL。

1.2.5 樣品分析 分別吸取各樣品的游離氨基酸供試液和酸、堿水解液,在相同的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以保留時(shí)間定性,以計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析定量,得到各氨基酸的含量結(jié)果。其中游離氨基酸供試液測(cè)得結(jié)果即為樣品中游離氨基酸含量;酸、堿水解液測(cè)得結(jié)果為樣品中總氨基酸含量;樣品中結(jié)合氨基酸含量=總氨基酸含量-游離氨基酸含量。

1.3 營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

利用年世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(WHO/FAO)1973年修正的理想蛋白質(zhì)人體必需氨基酸模式譜,計(jì)算上述樣品中必需氨基酸(EAA)的氨基酸比值(RAA),氨基酸比值系數(shù)(RC)及比值系數(shù)分(SRC)[13]。

RAA=(待評(píng)蛋白質(zhì)EAA含量)/(模式譜中相應(yīng)EAA含量)

RC=(RAA)/(RAA的平均值)

SRC=100-CV×100,式中:CV為RC的變異系數(shù);CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均值。

其中RAA表明樣品蛋白質(zhì)中某種EAA含量是WHO/FAO模式譜中相應(yīng)EAA倍數(shù);RAA和RC越接近1,表明該氨基酸越接近WHO/FAO模式譜,RC>1表明該種必需氨基酸相對(duì)過(guò)剩,RC<1表明該氨基酸相對(duì)不足;RC最小者則為第一限制性氨基酸;SRC越接近100,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高,SRC越小,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越低。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel對(duì)不同批次樟芝菌粉中游離氨基酸及結(jié)合氨基酸的含量進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟芝菌粉中游離氨基酸分析

以標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液為對(duì)照品,上述樣品經(jīng)柱前衍生高效液相色譜測(cè)定,得到圖1、圖2。

圖1 20種氨基酸對(duì)照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of 20 amino acids reference substances注:1.天門冬氨酸(Asp)；2.谷氨酸(Glu)；3.絲氨酸(Ser)；4.組氨酸(His)；5.甘氨酸(Gly)；6.蘇氨酸(Thr)；7.精氨酸(Arg)；8.丙氨酸(Ala)；9.酪氨酸(Tyr)；10.胱氨酸(Cys)；11.纈氨酸(Val)；12.蛋氨酸(Met)；13.苯丙氨酸(Phe)；14.異亮氨酸(Ile)；15.亮氨酸(Leu)；16.賴氨酸(Lys)；17.脯氨酸(Pro)；18.谷氨酰胺(Gln)；19.γ-氨基丁酸(GABA)；20. 色氨酸(Trp)。

圖2 樟芝菌粉(S7)中游離氨基酸HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of free amino acids in sample(S7)

經(jīng)LC 3D色譜數(shù)據(jù)工作站分析,以折線圖表示不同批次樟芝菌粉、椴木栽培樟芝子實(shí)體和靈芝中游離氨基酸的種類和含量,得到圖3。由圖可見,10批次樟芝菌粉中游離氨基酸呈現(xiàn)非常相似的分布態(tài)勢(shì)。

不同批次樟芝菌粉中,除S3含有19種氨基酸外(未檢測(cè)到天冬氨酸),其余樣品均含有20種氨基酸,樟芝菌粉中游離氨基酸總含量范圍為96.12～132.87mg/g,RSD為11.20%,表明10批次菌粉間游離氨基酸總含量的差異較小;樟芝子實(shí)體(S11)中含有13種氨基酸,靈芝中(S12)為11種,兩者氨基酸總含量分別為13.25、10.54mg/g,均遠(yuǎn)低于樟芝菌粉。不同批次樟芝菌粉中均以纈氨酸含量最高,色氨酸含量普遍最低;而樟芝子實(shí)體和靈芝則以脯氨酸的含量最高。

圖3 樣品中游離氨基酸的含量Fig.3 Content of free amino acids in samples

2.2 樟芝菌粉中結(jié)合氨基酸分析

按“1.2.5”項(xiàng)下方法計(jì)算樣品中結(jié)合氨基酸含量。如表1及圖4所示,樟芝菌粉中檢測(cè)出18種結(jié)合氨基酸,其總含量范圍為393.85～632.45mg/g,RSD為13.61%,表明10批次菌粉間結(jié)合氨基酸總含量的差異較小。樟芝子實(shí)體、靈芝中分別檢測(cè)出17、16種結(jié)合氨基酸,其總含量遠(yuǎn)低于樟芝菌粉。不同批次菌粉均以谷氨酸含量最高;而樟芝子實(shí)體和靈芝則以脯氨酸含量最高。

不同批次樟芝菌粉必需氨基酸與總氨基酸比值(EAA/TAA)為24.06%(平均值),必需氨基酸與非必需氨基酸比值(EAA/NEAA)為31.81%,樟芝子實(shí)體EAA/TAA=23.03%,靈芝EAA/TAA=25.37%,均未達(dá)到WHO/FAO提出的理想蛋白質(zhì)EAA/TAA=40%,EAA/NEAA=60%的標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 樟芝菌粉(S7)水解液中氨基酸HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of amino acids in hydrolyzate of sample(S7)

表1 樣品中結(jié)合氨基酸組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)Table 1 Composition and concentration of combinative amino acids in samples(mg/g)

表2 各種必需氨基酸與WHO/FAO模式譜的比較Table 2 Comparision among human essential amino acide composition of samples and WHO/FAO recommeded pattern

2.3 營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

本文采用氨基酸比值系數(shù)法對(duì)樟芝菌粉中氨基酸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià),該方法根據(jù)氨基酸平衡理論設(shè)計(jì)而成。如果蛋白質(zhì)中必需氨基酸齊全,且比例越接近或符合WHO/FAO的氨基酸模式要求,則其蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高。將樟芝菌粉中各種必需氨基酸與模式譜進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)樟芝菌粉中除苯丙氨酸+酪氨酸外,其余幾種必需氨基酸均低于WHO/FAO模式譜(表2)。樟芝子實(shí)體和靈芝中除亮氨酸外,其余氨基酸所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于模式譜。

根據(jù)表2進(jìn)一步計(jì)算得出樟芝菌粉蛋白質(zhì)的RAA、RC、SRC值,結(jié)果見表3。由RC值可知(表3),10批次菌粉中蛋氨酸+半胱氨酸普遍相對(duì)不足,為第一限制性氨基酸。賴氨酸為樟芝子實(shí)體中第一限制性氨基酸。蛋氨酸+半胱氨酸為靈芝中第一限制性氨基酸。樟芝菌粉、樟芝子實(shí)體、靈芝的SRC分別為51.831、42.081、24.387,說(shuō)明樟芝菌粉中的蛋白質(zhì)有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.4 樟芝菌粉中游離氨基酸與結(jié)合氨基酸的比較

分別計(jì)算10批次樟芝菌粉中各游離氨基酸與結(jié)合氨基酸含量的平均值,結(jié)果見表4。

結(jié)果表明,樟芝菌粉中含有游離氨基酸20種,結(jié)合氨基酸18種,并都含有8種人體必需氨基酸。游離氨基酸中另含有谷氨酰胺(Gln)和γ-氨基丁酸(γ-GABA),Gln可通過(guò)抑制蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)各組分形成、前炎癥因子和支鏈氨基酸的釋放、誘導(dǎo)熱休克蛋白的產(chǎn)生等方式來(lái)抑制蛋白質(zhì)的降解[14];γ-GABA是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸,是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有降壓、治療癲癇、增強(qiáng)免疫力、鎮(zhèn)痛、健腦等功效[15],已被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品,開發(fā)利用γ-GABA成為當(dāng)前食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[16]。

表3 部分氨基酸的RAA、RC和SRC分析結(jié)果Table 3 The RAA，RC and SRC of amino acids

表4 樟芝菌粉中的氨基酸含量(mg/g)Table 4 Content of amino acids in Antrodia camphorata powder(mg/g)

本文測(cè)定的樟芝菌粉γ-GABA含量為1.57mg/g,高于臭靈丹草、龍眼[17-18]。樟芝菌絲體中,以游離態(tài)存在的氨基酸含量最高的為纈氨酸,結(jié)合態(tài)中含量最高的為谷氨酸;必需氨基酸中,游離態(tài)以纈氨酸含量最高,結(jié)合態(tài)以亮氨酸含量最高,這表明樟芝菌粉中氨基酸代謝的復(fù)雜性[19]。除天門冬氨酸、纈氨酸、蛋氨酸外,其余各氨基酸的結(jié)合態(tài)含量均高于游離態(tài)。RSD結(jié)果表明,游離氨基酸中胱氨酸、天門冬氨酸、蛋氨酸的含量在10批次菌粉間的差異較大,而結(jié)合氨基酸中以蛋氨酸、脯氨酸、天門冬氨酸的含量差異較大,其中蛋氨酸、脯氨酸在結(jié)合態(tài)中的含量差異明顯大于游離態(tài)。

3 結(jié)論

10批次樟芝菌粉在氨基酸總量、必需氨基酸總量、EAA/TAA、EAA/NEAA值等方面差異較小,驗(yàn)證了樟芝菌粉發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性。樟芝菌粉中游離態(tài)氨基酸的種類多于結(jié)合態(tài),但結(jié)合氨基酸總量和多數(shù)結(jié)合氨基酸的含量均高于游離態(tài)。樟芝菌粉中含有1種非蛋白氨基酸(γ-氨基丁酸),其含量為1.25～2.09mg/g,可作為γ-氨基丁酸的主要原材料用于新資源食品的開發(fā)。營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,樟芝菌粉氨基酸配比的合理性不高,有待進(jìn)一步探討。從氨基酸總量、必需氨基酸總量、EAA/TAA、EAA/NEAA、SRC值等指標(biāo)綜合判斷,樣品氨基酸品質(zhì)高低順序?yàn)檎林ゾ?樟芝子實(shí)體>靈芝。本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生化HPLC法對(duì)不同批次、不同培植方法樟芝以及靈芝中氨基酸進(jìn)行分析,并對(duì)其進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià),為樟芝菌粉的開發(fā)利用、藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。

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Analysis and nutritional evaluation ofamino acids inAntrodiaCamphoratapowder

CHEN Fei,ZHANG Feng-su,LIU Xun-hong*,YANG Nian-yun,HOU Ya,MA Yang

(Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)

To establish a method for determination of amino acids inAntrodiacamphoratapowder by HPLC with pre-column derivatization and for the evaluation of their nutritions. The samples were derived with o-phthalaldehyde(OPA). HPLC was performed on a Thermo Hypersil GOLD Dim column(150mm×4.6mm,3μm)with gradient elution of 20mmol/L sodium acetate-0.3% tetrahydrofuran-0.02% triethylamine(pH7.2)(A)and 100mmol/L sodium acetate-methanol-acetonitrile(200∶450∶350)(B)at the flow rate of 1mL/min,detected at 338.1nm. Besides,the method of ratio coefficient of amino acid was used for its evaluation of nutrition. The results showed that there were 20 free amino acids and 18 combinative amino acids inAntrodiacamphoratapowder,which indicated that the samples had abundant amino acids. In addition to Phe+Tyr,the contents of other essential amino acids were lower than that in WHO/FAO mode. Met+cys was the first limiting amino acid. The γ-aminobutyric acid was identified in the powders,and its average content was 1.57mg/g.

Antrodiacamphoratapowder;amino acids;pre-column derivatization HPLC;nutritional evaluation

2014-05-27

陳菲(1989-)，女，在讀碩士研究生，主要從事中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。

*通訊作者:劉訓(xùn)紅(1959-)，男，碩士，教授，主要從事中藥資源化學(xué)與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(ysxk-2010)；南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)史文獻(xiàn)學(xué)科資助項(xiàng)目(WF2013-07)。

TS282.71

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1002-0306(2015)05-0286-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.052