張文娟,潘靈剛,陶 緣,王亞軍,李 昕,王瑞花,陳健初,5,*,葉興乾,5

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 3100582.浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心,浙江杭州 310058;3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058;4.西安航空學(xué)院理學(xué)院,陜西西安 710077;5.浙江大學(xué)馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

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張文娟1,2,3,潘靈剛4,陶 緣1,2,3,王亞軍1,2,3,李 昕1,2,3,王瑞花1,2,3,陳健初1,2,3,5,*,葉興乾1,2,3,5

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 3100582.浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心,浙江杭州 310058;3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058;4.西安航空學(xué)院理學(xué)院,陜西西安 710077;5.浙江大學(xué)馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

應(yīng)用微波輔助提取椪柑幼果中的總黃酮。研究微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間及液固比四個(gè)單因素對(duì)于總黃酮提取量的影響,并利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,評(píng)價(jià)椪柑幼果的微波提取液對(duì)于DPPH自由基的清除能力。結(jié)果表明:在微波功率616W,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,微波時(shí)間40s,液固比30(g/mL)的提取條件下,重復(fù)三次實(shí)驗(yàn),椪柑幼果中總黃酮的平均提取量達(dá)到24.9452mg RT/g DW。椪柑幼果微波提取液的濃度為0.67mg/mL時(shí),TEAC值為13.3054mg/g DW,對(duì)DPPH·的清除率可以達(dá)到48.4023%,椪柑幼果微波提取液對(duì)DPPH·有一定的清除作用。

椪柑,總黃酮,微波輔助提取,DPPH·

柑橘為世界水果產(chǎn)量之首,是第三大國(guó)際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品[1]。我國(guó)柑橘栽培面積世界第一、產(chǎn)量居第三位,資源豐富,品種多產(chǎn)量大。柑橘果實(shí)中含有葉酸、類(lèi)胡蘿卜素等維生素,柑橘類(lèi)黃酮具有抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌等生理功能[1-3]。柑橘中所含有的黃酮類(lèi)物質(zhì)主要為黃烷酮、黃酮、黃酮醇及僅存在于血橙中的花色苷,黃酮類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降低毛細(xì)血管脆性、抗過(guò)敏、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和膽固醇增加等多方面的藥理作用[1,3]。

目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道柑橘中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取方法主要有:醇浸提法、加熱回流提取法、閃式提取法、酶輔助提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、高速逆流色譜法和超濾法[2,4]。其中微波輔助提取較傳統(tǒng)回流提取和超聲提取相比,具有操作簡(jiǎn)便,大大縮短提取時(shí)間,節(jié)能環(huán)保[4]。

由于各種原因每年有大量的柑橘幼果在成熟前脫落[5],僅貴州省的桐梓縣每年就有0.8萬(wàn)噸的柑橘落果[6],因而柑橘幼果成為具有工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值的原料。本文選取的是浙江省產(chǎn)量較大的柑橘品種之一椪柑,于落果期收集椪柑幼果,在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),探究微波輔助提取椪柑幼果總黃酮的最佳工藝,并對(duì)該工藝條件下的提取液的抗氧化活性進(jìn)行研究,為椪柑幼果的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

椪柑幼果(CitruspoonensisHort. ex Tanaka) 購(gòu)自浙江省衢州市某公司;蘆丁,二苯代苦味酰(DPPH),水溶維生素E(Trolox) 購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 均為國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)自Aladdin公司。

DFT-50型粉碎機(jī) 浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司;GB204電子天平 瑞士Mettler Tikedo公司;MM823EE3-PW美的微波爐 廣東美的微波電器制造有限公司;UV-2550紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 曰本島津公司;DHG-9070A烘箱 杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠(chǎng);循環(huán)水真空泵 SHZ-III上海亞榮儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 椪柑幼果中總黃酮提取的工藝路線(xiàn) 椪柑幼果→60℃烘干→過(guò)篩→與乙醇溶液混合→微波提取→過(guò)濾→測(cè)定總黃酮含量。

1.2.2 操作方法 椪柑幼果粉碎后,過(guò)80目篩和200目篩,收集截留在兩篩之間的椪柑粉末。在一定的乙醇溶液、微波功率、微波時(shí)間、液固比的條件下進(jìn)行微波提取,過(guò)濾,濾液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 參考Kim等的方法,并稍作改動(dòng)[7]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25.04mg,置于100mL棕色容量瓶中,用30%乙醇溶解并定容至刻度,搖勻,配制成0.2504mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確移取0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至25mL比色管內(nèi),用30%的乙醇補(bǔ)充體積至5mL,漩渦震蕩使之混勻,分別加入0.3mL濃度為5%的亞硝酸鈉溶液,搖勻后靜置5min,加入0.3mL濃度10%的硝酸鋁溶液,震蕩混勻后靜置6min,加4mL濃度為1mol/L氫氧化鈉溶液,補(bǔ)加30%乙醇溶液使反應(yīng)體系的總體積為10mL,震蕩混勻,暗處?kù)o置10min后,在510nm下測(cè)定吸光度,以30%乙醇作為空白參比。

椪柑幼果微波提取液中總黃酮的測(cè)定,取0.4mL提取液于25mL比色管中,補(bǔ)加4.6mL的30%乙醇,其余操作按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的顯色方法進(jìn)行,總黃酮含量用蘆丁當(dāng)量RT(Rutin equvalent)表示。

1.2.4 總黃酮含量計(jì)算公式 椪柑幼果總黃酮含量(mg RT/g DW)=提取液中總黃酮含量(mg RT)/椪柑幼果粉末的質(zhì)量(g)

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g椪柑幼果粉末于100mL錐形瓶中,加入20mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液,微波功率為440W,微波時(shí)間為40s作為進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。當(dāng)研究某一單因素時(shí),其他條件保持不變。設(shè)置微波爐分別為低火、中低火、中火、中高火、高火檔,根據(jù)美的MM823EE3-PW微波爐使用說(shuō)明書(shū),計(jì)算出提取椪柑幼果黃酮時(shí)的相應(yīng)微波功率分別為136、264、440、616、800W,考察上述不同的微波提取功率,乙醇體積分?jǐn)?shù)(10%、30%、50%、70%、90%)、微波時(shí)間(0、20、40、60、80s)、液固比(10、20、30、40、50mL/g)等因素對(duì)提取液中黃酮提取量的影響,確定各因素的最優(yōu)范圍。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間、液固比為椪柑幼果總黃酮提取量的影響因素,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,因素水平見(jiàn)表1,確定最佳提取工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 DPPH自由基的清除作用 通過(guò)測(cè)定抗氧化物質(zhì)與DPPH·反應(yīng)而顏色變淺來(lái)反映清除自由基能力,以Trolox當(dāng)量(TEAC)或半抑制濃度(IC50)表示抗氧化能力。該方法操作簡(jiǎn)單,被廣泛應(yīng)用于定量測(cè)定植物提取物、食品成分和其它活性成分的抗氧化能力。

參考Gorinstein等的方法,并稍作改動(dòng)[8]。椪柑幼果微波提取液清除DPPH·能力的測(cè)定,將椪柑幼果的微波提取液用乙醇稀釋至適宜濃度,移取2.8mL的DPPH·溶液,加入0.2mL稀釋后的提取液,震蕩充分混合,室溫避光反應(yīng)30min,于517nm下測(cè)定吸光度,空白對(duì)照為0.2mL乙醇溶液。以濃度范圍為20～160μg/mL 的Trolox乙醇溶液為標(biāo)樣,測(cè)定吸光度,并以吸光度和Trolox濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),椪柑幼果的微波提取液抗氧化能力用DPPH·清除率和Trolox當(dāng)量(TEAC)兩種方法來(lái)表示。

式中:A1為所測(cè)柑橘幼果微波提取液的吸光值；A2為空白對(duì)照品吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

如圖1所示,以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程:

y=11.6243x-0.0005,相關(guān)系數(shù)r=0.9999,表明線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standardcurve for total flavonoid content

2.2 微波提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 微波功率對(duì)椪柑幼果總黃酮提取量的影響 由圖2可知,隨著微波功率的增大,椪柑幼果總黃酮的提取量隨著也增大,在功率超過(guò)616W之后隨著微波功率的增大,黃酮提取量下降。馮紀(jì)南等研究微波輔助提取資興柑橘皮中總黃酮的工藝條件發(fā)現(xiàn),當(dāng)微波功率超過(guò)600W時(shí)會(huì)造成黃酮提取量下降,與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。隨著溫度的升高,溶劑的表面張力和粘性都會(huì)有所降低,細(xì)胞快速破裂,從而使溶劑的滲透力和對(duì)樣品的溶解力增加[9-10],但是過(guò)高的功率,局部瞬間高溫會(huì)使椪柑幼果粉末中的蛋白質(zhì)凝固,從而不利于黃酮的溶出[11-12]。因此,在本研究中,總黃酮提取的最佳微波功率為616W。

圖2 微波功率對(duì)黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of microvavepower on flavouoid yield

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)椪柑幼果總黃酮提取量的影響 由圖3可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,總黃酮提取量逐漸增加;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～70%時(shí),總黃酮提取量處于較高水平,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大,總黃酮提取量明顯下降。微波加熱時(shí),主要是物料中的極性分子尤其是水分子吸收微波能,產(chǎn)生大量的熱量,乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大濃度減少了料液中水的比例,會(huì)使料液升溫減慢,使得黃酮的含量降低[13]。因此本實(shí)驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%較為適宜。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on flavonoid yield

2.2.3 微波提取時(shí)間對(duì)椪柑幼果總黃酮提取量的影響 由圖4可知,隨著微波提取時(shí)間的增加,總黃酮提取量先增加后降低,提取時(shí)間為40s提取量最高,超過(guò)40s后,微波處理時(shí)間的增加導(dǎo)致熱量急劇增加,高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)及雜質(zhì)的沉淀,從而影響黃酮的溶出,同時(shí),時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致液體沸騰,造成溶劑浪費(fèi),帶走目標(biāo)產(chǎn)物[9],因此,選擇微波處理時(shí)間為40s。

圖4 微波提取時(shí)間對(duì)果膠得率的影響Fig.4 Effect of extractingtime on flavonoid yield

2.2.4 液固比對(duì)椪柑幼果總黃酮提取量的影響 由圖5可知,總黃酮提取量隨著液固比的增大而增加,當(dāng)液固比大于20mL/g時(shí),總黃酮提取量則隨著液固比的增大而減小。液固比增大能夠加快傳質(zhì)過(guò)程,但是,溶劑的增加同時(shí)也稀釋提取物黃酮的濃度,提取量反而下降。因此,選擇液固比為20mL/g。

圖5 液固比對(duì)黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of liquid-to-solid ratio on flavonoi dyield

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)的極差分析 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示,極差R值大小反映因素對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大小,R越大,則表明該因素對(duì)于總黃酮提取量的影響越大。由極差分析可知,四個(gè)因素對(duì)于椪柑幼果中總黃酮提取量的影響主次順序?yàn)锽>D>C>A,即:乙醇體積分?jǐn)?shù)>液固比>微波時(shí)間>微波功率。由此可以確定最佳工藝條件為A3B1C2D3,即微波功率616W,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,微波時(shí)間40s,液固比30(g/mL)。按照最佳工藝參數(shù)進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)3次,發(fā)現(xiàn)椪柑幼果中總黃酮的提取量達(dá)到24.9452mg RT/g DW,均高于其他各正交實(shí)驗(yàn)值。說(shuō)明該優(yōu)化工藝條件合理科學(xué),穩(wěn)定可靠。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

2.4 椪柑幼果總黃酮的抗氧化活性

DPPH·清除實(shí)驗(yàn)中,摸索出椪柑幼果微波提取液稀釋50倍較為合適,質(zhì)量濃度為0.67mg/mL。吸光度y與Trolox濃度x之間的回歸方程:y=-0.031x+1.080,相關(guān)系數(shù)r=0.9995,表明線(xiàn)性關(guān)系良好。通過(guò)回歸方程計(jì)算出提取液的TEAC當(dāng)量為13.3054TEAC mg/g DW。當(dāng)椪柑幼果微波提取液濃度為0.67mg/mL時(shí),通過(guò)1.2.7中DPPH·清除率的計(jì)算公式算出提取液對(duì)DPPH·的清除率可以達(dá)到48.4023%,具有一定的抗氧化活性。

徐貴華[14]將成熟椪柑果皮的甲醇超聲輔助10min后所得提取液,測(cè)定對(duì)于DPPH·的清除作用,其TEAC值為8.7TEAC mg/g DW。張?jiān)穼⒊墒炱诘臈崭坦ず凸夥謩e用80%甲醇震蕩提取12h后,測(cè)定對(duì)于DPPH·的清除作用,其TEAC值分別為9.10、3.13TEAC mg/g DW[15]。說(shuō)明了在DPPH體系中,椪柑幼果較成熟期果實(shí)具有較強(qiáng)的抗氧化能力,微波提取相比于超聲提取和震蕩提取具有節(jié)省時(shí)間,提取效率較高。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),確定了微波提取椪柑幼果中的總黃酮的最佳工藝參數(shù),在微波功率616W,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,微波時(shí)間40s,液固比30(mL/g)的提取條件下,重復(fù)三次實(shí)驗(yàn),椪柑幼果中總黃酮的平均提取量達(dá)到24.9452mg RT/g DW,各因素對(duì)提取量的影響主次順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)>液固比>微波時(shí)間>微波功率。微波提取椪柑幼果總黃酮能夠有效縮短提取時(shí)間,操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)應(yīng)該注意的是微波輔助提取活性成分的過(guò)程要謹(jǐn)慎選擇可靠的參數(shù)條件及優(yōu)化最佳工藝。

在DPPH體系中,椪柑的微波提取液稀釋50倍后測(cè)定體外抗氧化活性。測(cè)定結(jié)果表明為13.3054TEAC mg/g DW,DPPH·的清除率可以達(dá)到48.4023%,表明椪柑幼果的乙醇微波提取液具有一定的抗氧化活性。因此微波提取椪柑幼果具有一定的研究開(kāi)發(fā)潛力與價(jià)值,本文為椪柑幼果的綜合開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Study on the optimization of the microwave-assisted extraction oftotal flavonoid and antioxidant capacity in young fruits ofPonkan(CitruspoonensisHort. ex Tanaka)

ZHANG Wen-juan1,2,3,PAN Ling-gang4,TAO Yuan1,2,3,WANG Ya-jun1,2,3,LI Xin1,2,3,WANG Rui-hua1,2,3,CHEN Jian-chu1,2,3,5,*,YE Xing-qian1,2,3,5

(1. College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2. Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing,Hangzhou 310058,China;3. Zhejiang R & D Center for Food Technology and Equipment,Hangzhou 310058,China;4. Faculty of Science,Xi’an Aeronautical University,Xi’an 710077,China;5.Fuli Institute of Food Science,Hangzhou 310058,China)

Orthogonal design was used to optimize the microwave-assisted extraction of total flavonoid from young fruits ofCitruspoonensisHort. ex Tanaka. Flavonoid yield was investigated with respect to four process conditions including microwave power,ethanol concentration,solid-to-solvent ratio and microwave time. The antioxidant activity of the ethanol extract was evaluated by DPPH· assays. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows:616W of microwave power,50% of ethanol concentration,40s of microwave treatment time,and 30(g/mL)of solid-to-solvent ratio. Validation experiments were carried out at these optimum conditions and the results indicated that the total flavonoid yield was 24.9452mg RT/g DW. The result indicated that the ethanol extract possessed antioxidant with the TEAC value of 13.3054mg/g DW and the radical scavenging activity 48.4023% at 0.67mg/mL.

CitruspoonensisHort. ex Tanaka;total flavonoid;microwave-assisted extraction;DPPH·

2014-05-15

張文娟(1989-),女,碩士生在讀,研究方向:柑橘功能成分研究。

*通訊作者:陳健初(1964-),男,博士,教授,研究方向:食品加工與工程。

國(guó)家科技攻關(guān)項(xiàng)目;柑橘加工副產(chǎn)物高效轉(zhuǎn)化關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化示范(2012BAD31B02)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)05-0223-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.038