戴宏杰,孫玉林,鄭小林,陳道海,*

(1.嶺南師范學院生命科學與技術學院,廣東湛江524048;2.浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江杭州 310018

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擬目烏賊生殖腺多糖提取工藝優(yōu)化及自由基清除能力研究

戴宏杰1,2,孫玉林1,鄭小林2,*,陳道海1,*

(1.嶺南師范學院生命科學與技術學院,廣東湛江524048;2.浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江杭州 310018

以擬目烏賊生殖腺為材料,在對料液比、提取時間及提取溫度進行單因素實驗的基礎上,采用Box-Benhken實驗設計優(yōu)化熱水浸提法提取多糖工藝,并通過清除超氧陰離子和羥基自由基的能力探究其體外抗氧化活性。結果表明:擬目烏賊生殖腺多糖熱水浸提法最佳提取工藝條件為料液比1∶30g/mL,提取溫度 90℃,提取時間1h,在此條件下擬目烏賊生殖腺多糖得率為0.751%;擬目烏賊生殖腺多糖對超氧陰離子自由基和羥自由基均有一定的清除能力,清除率與多糖濃度呈正相關性;紅外圖譜顯示該多糖主要是β-型糖苷鍵連接的吡喃型葡聚糖。

擬目烏賊生殖腺,多糖,提取,抗氧化活性,紅外光譜

多糖具有多種生物活性,如提高免疫、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗輻射等[1],近年來由于人們對海洋藥物的重視,從海洋生物中提取多糖得到廣泛關注,Murray[2]在研究發(fā)現許多海洋動物都含具有生物活性的多糖。目前從蛤蜊[3]、鮑魚[4]、文蛤[5]、海參[6]等海洋動物中都已分離出具有生物活性的多糖。

擬目烏賊(Sepialycidas)屬于軟體動物門(Mollusca),頭足綱(Cephalopoda),烏賊目(Sepiida),烏賊科(Sepiidae),烏賊屬(Sepia),主要分布于我國東海、南海,菲律賓海,越南和婆羅洲海域[7]。由于擬目烏賊體型較大、繁殖周期短、生長迅速、肉質鮮美、蛋白質含量高以及綜合利用范圍廣等特點[8],越來越多的學者投入到擬目烏賊人工養(yǎng)殖技術的研究中并取得較大進展[9-10]。隨著擬目烏賊產量的增加,必然會導致占體質量30%的內臟等加工副產物增多,生殖腺作為內臟的主要組成部分,已有研究表明野生擬目烏賊生殖腺多糖含量約為鮮重的0.23%[11]。研究發(fā)現從烏賊墨[12]、海螵鞘[13]中分離的多糖均有顯著的抗腫瘤活性,但是對擬目烏賊生殖腺多糖的提取及生物活性研究尚未見報道。

本文采用傳統的水提法提取擬目烏賊生殖腺多糖,通過響應面法對提取工藝進行優(yōu)化,并對所提取多糖的抗氧化性進行初步研究,同時利用傅里葉紅外光譜對其結構進行初步探討,以期為擬目烏賊生殖腺多糖的工業(yè)生產、分離純化、結構分析及生物活性研究提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

擬目烏賊 材料購于湛江市霞山水產品批發(fā)市場,經鑒定為雌性擬目烏賊成體;苯酚、無水乙醇、濃硫酸、丙酮、葡萄糖、鄰苯三酚、鄰二氮菲、三氨基甲烷、硫酸亞鐵等均為分析純。

高速組織搗碎機(DS-1型) 上海標本模型廠;手提式高速中藥粉碎機(DFY-200) 青州市三寶中藥機械廠;冷凍干燥機(LGJ-18型) 北京四環(huán)科學儀器廠;電子天平(AUX320型) 日本島津公司;電熱恒溫水浴鍋(HHS型) 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;旋轉蒸發(fā)器(RE-52A 型) 上海亞榮生化儀器廠;臺式離心機(H/T 18MM型) 湖南赫西儀器裝備有限公司;紫外可見分光光度計(UV3000型) 上海美譜達儀器有限公司;傅立葉紅外光譜分析儀(Nicolet 6700型) 賽默飛世爾科技公司。

1.2 擬目烏賊生殖腺多糖提取工藝

擬目烏賊生殖腺多糖制備[14]:擬目烏賊生殖腺凍干粉的制備:擬目烏賊解剖取生殖腺,切分、搗碎、丙酮脫脂3次,冷凍干燥后粉碎,置于-20℃?zhèn)溆?。凍干粉在設定料液比下熱水浸提一定時間,離心取上清,濃縮,加入3倍體積無水乙醇4℃沉淀過夜,離心取沉淀透析48h,冷凍干燥24h得擬目烏賊生殖腺多糖。

1.3 擬目烏賊生殖腺多糖含量的測定方法

采用苯酚硫酸法測定樣品中多糖含量[15]。精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖配置成100μg/mL葡萄糖標準溶液,分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL葡萄糖標準溶液于試管中,補水至2mL,然后按順序向各試管內加入1mL 6%苯酚溶液,搖勻后速加入5mL濃硫酸,室溫下放置30min,測定490nm處吸光值。按下式計算擬目烏賊生殖腺多糖得率:

式(1)

式中:R-多糖得率,%;C-待測液中多糖質量濃度,mg/mL；V-待測液體積,mL;N-稀釋倍數;m-擬目烏賊生殖腺樣品質量,g。

1.4 提取工藝單因素實驗設計

在保持其它因素條件相同下,分別設置料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL,浸提溫度50、60、70、80、90℃,浸提時間0.5、1、1.5、2、2.5h,考察各因素對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響,每個因素平行實驗三次,取平均值。

1.5 提取工藝響應曲面法優(yōu)化實驗設計

在單因素實驗的基礎上,采用 Box-Behnken 設計方法以料液比(A)、提取時間(B)和提取溫度(C)3個因素為自變量進行組合優(yōu)化,多糖得率(Y)為響應值,平行實驗三次,進行響應面分析。利用 Design expert 8.0.6 軟件進行數據處理和回歸分析。實驗設計方案見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken design

1.6 擬目烏賊生殖腺多糖清除自由基能力的研究

1.6.1 清除超氧陰離子自由基能力的測定 根據文獻[16]方法,取1mL不同濃度的擬目烏賊生殖腺多糖溶液于試管中,加入4.5mL pH8.2的0.05mol/L Tris-HC1緩沖液、4.2mL蒸餾水混勻置于25℃水浴中預熱20min,加入25℃水浴預熱過的3mmol/L的鄰苯三酚溶液0.3mL(鄰苯三酚溶液用10mmol/L HCl配制),混勻后于325nm處測定吸光度A,每隔30s讀取吸光值,4min后結束。每個多糖濃度平行實驗三次取平均值,并與VC對照比較。作吸光值隨時間變化的回歸方程,其斜率為鄰苯三酚的自氧化速率Ks,以蒸餾水代替樣品為空白對照的自氧化速率為Ko。清除率計算公式為:

清除率(%)=(Ko-Ks)/Ko×100

式(2)

1.6.2 清除羥自由基能力的測定 按照文獻[17]方法,取0.75mmol/L 鄰二氮菲無水乙醇溶液1mL加入pH7.4的0.15mol/L的磷酸緩沖液2mL,加入1mL不同濃度擬目烏賊生殖腺多糖樣品溶液,混勻后加入0.75mmol/L的硫酸亞鐵溶液1mL,最后加入0.01% H2O2溶液1mL,在 37℃水浴反應60min,536nm測定其吸光度AC(樣品管);以同樣體積的蒸餾水代替樣品及H2O2溶液,于536nm測定其吸光度AB(未損傷管);以同樣體積的蒸餾水代替樣品溶液,于536nm測定其吸光度AO(未損傷管)。每一樣品平行測三次,取平均值,并與VC對照比較。清除率計算公式如下:

清除率(%)=(AC-AB)/(AO-AB)×100

式(3)

1.7 紅外光譜(IR)分析

取2mg干燥生殖腺多糖,KBr壓片,Nicolet 6700傅立葉紅外光譜分析儀4000～400cm-1區(qū)間掃描。

1.8 數據處理方法

所有數據均重復測定三次,采用Design expert 8.0.6軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

采用苯酚硫酸法測定得到的葡萄糖標準曲線回歸方程為:Y=7.5157X-0.0088,R2=0.9991;其中Y為吸光值,X為葡萄糖含量(mg/mL)。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 料液比對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響 分別選定料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL,在70℃條件下提取1.5h,研究料液比對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響,結果見圖1。

圖1 料液比對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響Fig.1 Effect of ratio of raw material to water on the yield of Sepia lycidas gonad polysaccharides

由圖1可知,料液比對多糖得率的影響較為明顯。隨著料液比的增加,擬目烏賊生殖多糖得率逐漸升高,當料液比在1∶10～1∶25g/mL時,多糖得率急劇增加;高于1∶25g/mL時,得率增加緩慢。分析原因可能是料液比影響多糖的溶出,料液比較低時,溶液黏度較高,不利于多糖擴散;達到一定料液比之后,多糖擴散將不再受影響?？紤]到節(jié)約資源以及后續(xù)離心、濃縮、醇沉等操作,料液比不宜過大,選擇1∶25g/mL為最適提取料液比。

2.2.2 提取溫度對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響 設定料液比為1∶25g/mL,分別在50、60、70、80、90℃條件下提取1.5h,考察提取溫度對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響,結果見圖2。

圖2 提取溫度對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of Sepia lycidas gonad polysaccharides

由圖2可知,隨著提取溫度的升高,擬目烏賊生殖腺多糖得率逐漸增加。分析其原因,溫度較低時,多糖的溶解度較低,不利于多糖的溶出;當溫度逐漸升高,多糖分子熱運動加劇,擴散速度加快,多糖得率上升。但是過高的提取溫度可能會導致多糖分子的結構破壞,綜合考慮80℃為最適提取溫度。

2.2.3 提取時間對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響 在料液比為1∶25g/mL、提取溫度為80℃條件下,分別提取0.5、1、1.5、2、2.5h,研究提取溫度對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響,結果見圖3。

圖3 提取時間對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of Sepia lycidas gonad polysaccharides

從圖3可以看出,隨著提取時間的增加,擬目烏賊生殖腺多糖得率也隨之增加,在提取時間達到1h之后,多糖得率增加趨勢變緩。這可能是擬目烏賊生殖腺經過脫脂、凍干、粉碎之后,凍干粉能與提取溶劑充分接觸,可在較短時間內使多糖溶出,繼續(xù)延長提取時間對多糖得率的增加不再明顯。因此,綜合考慮選擇1h為最適提取時間。

2.3 響應曲面法優(yōu)化實驗結果

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 在單因素實驗的基礎上,對料液比(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)按表1設計方案,采用Box-Behnken 設計方法設計響應面,優(yōu)化擬目烏賊生殖腺多糖提取工藝。實驗設計與結果見表2。利用Design expert 8.0.6軟件,對表2實驗數據建立二次回歸模型,得擬合二次多元回歸方程:

多糖得率(%)=0.73+0.018A+0.011B+0.011C+7.500E-3AB-0.014AC+4.000 E-3BC-4.333 E-3A2-3.333 E-4B2-0.011C2

式(4) 表2 響應曲面法優(yōu)化實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 回歸模型的方差分析結果Table 3 Variance analysis of the regression model

注:*表示在α=0.05 水平上顯著;**表示在α=0.01 水平上極顯著。 對上述模型進行方差分析,結果見表3。由表3可知,此模型的p=0.0005<0.01,響應面回歸模型達到極顯著水平;失擬項能表示模型預測值與實際值不擬合的概率,該失擬項p=0.1986>0.05,不顯著,說明該模型對本實驗擬合程度較好。R2(R-Square)=0.9822,表明該模型對實驗點的適配度達到98.22%,具有較高的擬合度;修正R2(Adj R-Square)=0.9502,表明該模型能解釋95.02% 響應值變化,實驗誤差較小,可以利用該模型預測上述提取條件對多糖得率的影響。分析模型回歸方程系數的p值,A、B、C、AC和 C2項的影響極顯著(p<0.01),AB影響顯著(p<0.05),AC、A2和B2影響不顯著。

根據方差分析結果,消去不顯著項,擬合方程簡化為:

多糖得率(%)=0.73+0.018A+0.011B+0.011C+7.500E-3AB-0.014AC-0.011C2

式(5)

2.3.2 響應面分析 利用Design expert 8.0.6軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合,所得到的二次回歸方程的響應面及其等高線見圖4。響應面圖形能較直觀地反映出各因素對響應值的影響,等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱,橢圓表示二因素交互作用顯著,而圓形則與之相反[18]。從圖4可以看出,料液比對擬目烏賊生殖腺多糖得率的影響最顯著,表現為曲面相對較陡,提取溫度和提取時間對多糖得率的影響次之。料液比和提取時間的交互作用極顯著,表現為等高線圖較扁平;料液比與提取溫度的交互影響次之,提取溫度與提取時間的相互影響最小。在所考察的因素范圍內,多糖得率隨料液比的增大而顯著增加;隨提取溫度的升高變化不明顯;隨提取時間的增加呈現緩慢上升的趨勢。

圖4 料液比、提取溫度和提取時間交互作用的響應面圖Fig.4 Response surface plots showing the effect of the ratio of raw material to water, extraction temperature and extraction time

2.3.3 優(yōu)化與驗證 采用Design expert 8.0.6軟件運用回歸模型優(yōu)化的擬目烏賊生殖腺多糖的最佳提取工藝為:料液比1∶30g/mL,提取溫度 90℃,提取時間1.02h,預測擬目烏賊生殖腺多糖得率為0.758%。為方便實際操作,驗證實驗時將上述最佳工藝條件修正為料液比1∶30g/mL,提取溫度90℃,提取時間1h,在該條件下平行實驗3次,多糖得率0.751%,與理論預測值相對誤差為0.92%,說明該模型能較好地預測擬目烏賊生殖腺多糖提取工藝,指導工業(yè)生產。

2.4 擬目烏賊生殖腺多糖對自由基清除能力結果分析

2.4.1 清除超氧陰離子自由基能力 按1.6.1實驗方法測定,并計算清除率,結果如圖5所示。超氧陰離子是生物體類產生的第一個氧自由基,能引起自由基鏈式反應,產生活性更強的自由基,如羥基自由基等,引起細胞損傷[19]。擬目烏賊生殖腺多糖對鄰苯三酚自氧化產生的超氧陰離子自由基具有一定的抑制作用,并隨濃度的增加其清除率逐漸增加,二者呈正相關。當多糖濃度達到10mg/mL時,對超氧陰離子自由基清除率接近70%,表明擬目烏賊生殖腺多糖對超氧陰離子自由基有一定的清除效果。但是和VC相比,其清除能力相對較弱,達到相同清除效果的VC濃度遠低于擬目烏賊生殖腺多糖,VC濃度為0.25mg/mL時,其清除率可達到100%。

圖5 多糖對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.5 Superoxide anion free radical scavenging abilities of polysaccharides

2.4.2 清除羥自由基能力 按1.6.2實驗方法測定,并計算清除率,結果如圖6所示。擬目烏賊生殖腺多糖和VC對羥自由基均有一定的清除作用,隨著質量濃度的增加,其清除羥自由基能力也相應增加,呈現良好的量效關系。當多糖質量濃度達到10mg/mL時,對羥自由基的清除率為39.77%,表明擬目烏賊生殖腺多糖對羥自由基具有一定的清除能力。當VC濃度為0.6mg/mL時,其清除率可達到41.52%,說明擬目烏賊生殖腺多糖對羥自由基的清除能力也遠低于維生素C。這可能和所提粗多糖未進行脫蛋白操作有關,呂明生等[20]對雪蓮薯多糖脫蛋白后,其清除羥自由基的能力大幅增強。

圖6 多糖對羥基自由基的清除作用Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging abilities of polysaccharides

2.5 擬目烏賊生殖腺多糖紅外光譜分析

擬目烏賊生殖腺多糖的紅外圖譜如圖7所示。在3449cm-1的較強峰是糖類-OH的伸縮振動峰,在2935cm-1的較弱峰是糖類C-H的伸縮振動,這兩個峰是糖類化合物典型的特征吸收峰。1650cm-1有一強吸收峰,是-CHO中C=O的伸縮振動;1447cm-1和1379cm-1是=CH2的變形吸收峰[21-22];在1044～1079cm-1處的吸收峰是吡喃環(huán)糖苷(C-O-C)的伸縮振動,是糖類的特征吸收峰,也是葡聚糖的典型吸收光譜信號;930-700cm-1為糖類的環(huán)振動吸收區(qū),在889cm-1處是典型的吡喃型葡聚糖和β-型糖苷鍵吸收峰[23]。綜上,擬目烏賊生殖腺多糖主要是β-型糖苷鍵連接的吡喃型葡聚糖。

圖7 擬目烏賊生殖腺多糖的紅外光譜圖Fig.7 IR spectrum of Sepia lycidas gonad polysaccharides

3 結論

熱水浸提法是多糖提取最常用的方法,較其它方法更溫和、經濟、簡單。本研究以擬目烏賊生殖腺為材料,采用熱水浸提法提取多糖,經過濃縮、醇沉、凍干等工藝得到白色海綿狀粗多糖。響應面優(yōu)化所得的擬目烏賊生殖腺多糖水提最佳工藝參數為:料液比1∶30g/mL,提取溫度90℃,提取時間1h,此條件下的平均得率為0.751%,與理論預測值相符,該工藝操作簡單,重復性好,可指導生產實踐。

生物體內自由基過多或清除緩慢均會引起分子、細胞甚至器官損傷,對于自由基清除作用的研究已成為新的熱點。目前人們使用較多主要是維生素C、維生素E和甘露醇等幾種抗自由基藥物,開發(fā)具有強效抗氧化功能的新型藥品具有重要意義。擬目烏賊生殖腺多糖具有一定的清除羥自由基、超氧陰離子自由基的能力,清除效果呈現良好的量效關系,可以探索作為食品工業(yè)和制藥行業(yè)的天然抗氧化劑;IR圖譜顯示擬目烏賊生殖腺多糖是β-型糖苷鍵連接的吡喃型葡聚糖,后續(xù)分離純化后可對其結構進一步分析。

對擬目烏賊生殖腺水提殘渣進行堿法提取時,得到一定量的堿溶性多糖。但是和水提多糖操作相比較,堿提多糖操作較繁瑣,提取液粘度較大且呈深黃色,有較濃的堿味,醇沉后得到黃色多糖,但相比水提法,其多糖得率更高,這可能和動物組織中酸性多糖較多有關。改善其脫色工藝后可對水提、堿提多糖分離純化、結構以及生物活性進行探討比較。

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食品安全責任險試點范圍擴至全國

中國保監(jiān)會會同國務院食品安全委員會辦公室、國家食品藥品監(jiān)管總局聯合印發(fā)《關于開展食品安全責任保險試點工作的指導意見》,標志著我國食品安全責任保險制度初步建立,相關試點工作將在全國范圍內啟動。

所謂食品安全責任保險,是以被保險人對因其生產經營的食品存在缺陷造成第三者人身傷亡和財產損失時依法應負的經濟賠償責任為保險標的的保險。

《指導意見》鼓勵以下領域的食品生產經營單位積極投保食品安全責任保險:食品生產加工環(huán)節(jié)的肉制品、食用油、酒類、保健食品、嬰幼兒配方乳粉、液態(tài)奶、軟飲料、糕點等企業(yè);經營環(huán)節(jié)的集體用餐配送單位、餐飲連鎖企業(yè)、學校食堂、網絡食品交易第三方平臺的入網食品經營單位等;當地特有的、屬于食品安全事故高發(fā)的行業(yè)和領域。

據了解,在《指導意見》下發(fā)之前,浙江、上海、山東等地就已率先通過政府引導的方式開展了食品安全責任保險的地方性試點。以首批獲得批準試點食品安全責任保險的長安責任保險股份有限公司為例,其客戶之一就是一家主要面向學校的用餐配送企業(yè)。

“學校配餐如果管理不好,后果很嚴重。”長安責任保險股份有限公司總經理李峰認為,有了食品安全責任保險后,萬一發(fā)生事故,保險公司可以預先支付,給予消費者及時賠付,也能有效轉移和減少企業(yè)的風險損失。

對于企業(yè)來說,投保食品安全責任保險也是一種信用背書。據保監(jiān)會有關負責人士介紹,《指導意見》將食品安全責任保險試點情況納入地方食品安全工作考核評價體系,企業(yè)投保情況也將納入企業(yè)信用記錄和分級分類管理指標體系,已投保企業(yè)可優(yōu)先獲得行業(yè)專項支持和政府扶持政策。

《指導意見》還提出,各地要充分發(fā)揮保險的風險控制和社會管理功能,探索建立政府、保險機構、企業(yè)、消費者多方參與、互動共贏的激勵約束機制和風險防控機制,為全面推行食品安全責任保險制度積累經驗。

來源：慧聰食品工業(yè)網

Study on the extraction optimization and antioxidant activity ofpolysaccharides in gonad ofSepialycidas

DAI Hong-jie1,2,SUN Yu-lin1,ZHENG Xiao-lin2,*,CHEN Dao-hai1,*

(1.Life Science and Technology School,Lingnan Normal University,Zhanjiang 524048,China;2.College of Food and Biological Engineering,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310018,China)

Using the gonad ofSepialycidasas raw material,optimization of extraction polysaccharides process was studied by using Box-Behnken design based on the results of single-factor test;antioxidant activity of polysaccharides was evaluated by its superoxide anion and hydroxyl free radical scavenging abilities. The results showed that the optimal extraction parameters were as follows:1∶30g/mL for ratio of raw material to water,90℃ for extraction temperature,and 1h for extraction time. Under the optimal conditions,the extraction rate of polysaccharides was 0.751%. The polysaccharides had good abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radical. It was indicated to a positive correlation with concentration of polysaccharides. IR spectrum showed that the polysaccharide was pyranoid glucan with β-glycosidic bond.

Sepialycidasgonad;polysaccharides;extraction;antioxidant activity;IR spectrum

2014-06-11

戴宏杰 (1990-)，男，碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏。

*通訊作者:陳道海(1963-)，男，博士，教授，研究方向：海洋藥用動物的開發(fā)利用與保護研究。 鄭小林(1966-)，男，博士，教授，研究方向：農產品加工與貯藏。

國家星火計劃項目(2012GA780020)；廣西科技合作與交流計劃項目，桂科合(1346011-25)；廣東省教育部產學研合作專項(2011B090400274)；廣東省海洋漁業(yè)技術推廣專項(A200899E01)；湛江市科技攻關項目(2011D0244)；嶺南師范學院博士啟動項目(ZL1313)。

TS254.1

B

1002-0306(2015)05-0198-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.033