段傳人，暴佳芳，石軼松，夏曉華，聶 磊，馮永芬，馬云霞,尚亞寧

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院,重慶 400044;2.重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)殖有限公司,重慶 400044)

?

枇杷花和油菜花蜂糧中微生物的分離與鑒定

段傳人1，暴佳芳1，石軼松1，夏曉華2，聶 磊1，馮永芬1，馬云霞1,尚亞寧1

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院,重慶 400044;2.重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)殖有限公司,重慶 400044)

以重慶云陽枇杷花和油菜花蜂糧為研究對象,對其發(fā)酵過程中的菌種探究。分離蜂糧發(fā)酵過程中的微生物,并通過形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定、26S rDNA序列同源性分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的方法對分離菌株進(jìn)行了生物學(xué)鑒定,確定其種屬。枇杷花中分離的酵母菌菌株與Zygosaccharomycesrouxiistrain(KC146358.1)高度同源,確定該菌株為魯氏酵母Zygosaccharomycesrouxii。并利用形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定方法對枇杷花蜂糧及油菜花蜂糧中的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定,枇杷花蜂糧中分離出5株菌株,其中MRS2、MC1、LB1這3株鑒定為乳酸球菌屬Lactococcuslactissubsp.1actis,另外2株MRS1、LB2為腸球菌屬Enterococcusdurans。油菜花蜂糧中分離出7株菌株,經(jīng)鑒定其為乳酸桿菌屬Lactobacillus,其中菌株MRS3、MC2、LB3、LB4為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum;菌株MRS4、MRS5、LB5為鼠李糖乳桿菌Lactobcacillusrhamnosus。這些菌種的分離為云陽地區(qū)的蜂糧微生物研究提供了科學(xué)內(nèi)容,為蜂糧產(chǎn)品的開發(fā)提供了可供選擇的菌株。

蜂糧,生理生化鑒定,酵母菌,乳酸菌

蜂糧也稱蜂巢花粉,是蜜蜂將花粉團(tuán)咬碎、吐蜜,分泌腺體濕潤等一系列初步加工后,在適當(dāng)?shù)臏囟葷穸葪l件經(jīng)過一定時間發(fā)酵所形成的蜂花粉釀制產(chǎn)物[1-2]。蜂糧在蜂巢中的產(chǎn)生過程主要通過微生物的發(fā)酵來完成[3-4],發(fā)酵產(chǎn)生的多種酶及營養(yǎng)成分更加有利于幼蜂的生長發(fā)育[5],是蜂群幼蟲生長發(fā)育的主要營養(yǎng)供給。蜂糧作為保健食品,除具有抗疲勞、保健美容、增強免疫力和記憶力等生理功能外,對肝炎、糖尿病、慢性支氣管炎、慢性胃炎、心血管病等各種慢性病也有很好的預(yù)防作用[2],而且其營養(yǎng)豐富,風(fēng)味獨特,易被消費者接受,目前成為一種極具開發(fā)前景的產(chǎn)品。天然蜂糧在蜂巢中發(fā)酵產(chǎn)生,產(chǎn)量有限,相比于其他蜂類產(chǎn)品,蜂糧的獲取則難以實施,主要原因是蜂糧是蜂群幼蟲的食物,大量采取會嚴(yán)重影響蜂群的繁殖,因此天然蜂糧至今無法在市場上大規(guī)模的銷售。

Chevtchik對新鮮花粉和蜂巢花粉的微生物進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵初期酵母菌參與了發(fā)酵過程[6]。研究報道酵母菌和乳酸菌是參與釀制蜂糧的主要微生物,在蜂糧發(fā)酵中起到非常重要的作用[7]。

枇杷花是云陽山地優(yōu)良的蜜源植物,蜂蜜資源豐富,品質(zhì)優(yōu)良[8-9]。油菜花在云陽也被廣泛種植,是除枇杷花之外云陽地區(qū)又一重要的蜜源和粉源植物[10]。目前在蜂糧微生物研究中未見枇杷花蜂糧和油菜花蜂糧微生物研究的報道。因此選取這兩種云陽地區(qū)重要粉源植物的蜂糧為研究對象,對其菌種進(jìn)行分離,從其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化以及26S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定,為蜂糧人工發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

枇杷花和油菜花蜂糧 重慶市云陽縣蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)殖有限公司蜂場;孟加拉紅培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基 北京路橋公司;自制MC培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基及用于生理生化實驗的培養(yǎng)基;pMD19-T載體 大連TakaRa公司;乳酸菌套裝生化鑒定管[11-12]杭州天和微生物試劑有限公司;自制革蘭氏染色試劑、過氧化氫試劑、吲哚試劑、甲基紅試劑。

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;H.H.S恒溫水浴鍋 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;OLYMPUS金相顯微鏡BX51M 廣州市明美光電技術(shù)有限公司;Hema9600珠海黑馬基因擴增儀 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司;16K珠海黑馬臺式離心機 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司;DYY-6C電泳儀電源 北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離 取枇杷花蜂糧1.0g放入裝有9.0mL無菌生理鹽水試管中,在漩渦混合器上充分混勻,稀釋度為10-1。利用稀釋梯度法將其稀釋,稀釋度為10-2、10-3、10-4、10-5。選取10-3、10-4、10-5共3個梯度,用移液器吸取200μL樣液,采用平板涂布法接入孟加拉紅培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基中,平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。觀察并記錄菌落形態(tài),并挑取不同形態(tài)單個菌落,進(jìn)行革蘭氏染色。將不同形態(tài)菌落接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基,于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,重復(fù)多次純化菌株。純化后的菌株接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面,30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 酵母菌形態(tài)學(xué)鑒定:蜂糧樣品稀釋液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基上,經(jīng)過發(fā)酵長出許多菌絲,挑出大小均勻,質(zhì)地粘稠,濕潤的菌落接種于孟加拉紅培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2d,將目的菌株用平板劃線法在PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3d,選擇單個菌落觀察其顏色、形狀、透明、光滑、濕潤和邊緣整齊等特征,并且用BX51M型顯微鏡OLYMPUS觀察細(xì)胞形狀、生殖方式。

假菌絲的形成和形態(tài):分離純化酵母菌用劃線接種于薄層玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上,其上蓋上滅菌蓋片(蓋片可用75%vol乙醇浸泡后,火焰燒去乙醇,待蓋片冷卻后蓋上),25～28℃培養(yǎng)3～5d后,用低倍顯微鏡觀察記錄蓋片下劃線兩旁是否形成假菌絲。

細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定:利用菌落外型觀察和革蘭氏染色法[13]和顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.2.3 生理生化鑒定 酵母菌生理生化實驗:包括糖類發(fā)酵實驗、碳源同化實驗、氮源同化對高濃度D-葡萄糖生長測定實驗等常規(guī)的生理生化反應(yīng)實驗。

細(xì)菌生理生化實驗:篩選的革蘭氏陽性菌株分別進(jìn)行10、45℃生長實驗,6.5% NaCl生長實驗、運動性實驗、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗、乳糖發(fā)酵、觸酶實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗、硫化氫實驗、淀粉水解實驗、甲基紅實驗、還原硝酸鹽實驗、乳酸菌套裝生化鑒定實驗。

1.2.4 酵母菌26S rDNA序列分析與分子鑒定 將純化的菌株接種于30mL無菌的PDA培養(yǎng)基中,置于30℃培養(yǎng)48h,采用CTAB法提取其基因組DNA。利用正向引物NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGA GGAA-3′,反向引物NL4:5′-GGTCCGTG TTTCAAG-3′[14],PCR擴增其26S rDNA片段。PCR擴增體系(50μL):模板2μL,d NTP(2.5mmol/L)4μL,引物(10μmol/L)NL1和NL4 各2μL,10×PCR buffer(含Mg2+)5μL,ddH2O 34μL,Taq酶(5U/μL)1μL。PCR擴增程序為:95℃ 5min;95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 15s,循環(huán)30次;72℃ 10min,4℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,回收并與pMD19-T載體相連接(反應(yīng)體系為10μL:pMD19-T載體0.5μL,PCR產(chǎn)物4.5μL,連接緩沖液5μL),16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化后挑陽性克隆驗證,經(jīng)北京六合華大基因科技股份有限公司完成測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行相似性比對;采用基因序列分析軟件DNAMAN和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹軟件MEGA5.22,與基因Bank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)屬種基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌分離

2.1.1 菌株形態(tài)鑒定結(jié)果 蜂糧樣品溶解后的稀釋液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中,經(jīng)培養(yǎng)獲得一株菌落大小均勻,質(zhì)地粘稠,濕潤的菌落,將其接種至PDA培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)2d后,菌落呈乳白色,表面濕潤、光滑、易挑起,菌落質(zhì)地均勻,外周、中央部位顏色一致。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)呈卵形,繁殖方式為芽殖,如圖1所示,呈兩邊出芽或多邊出芽,有時有假菌絲,將其命名為F1。

圖1 F1菌株顯微鏡觀察圖片(10×40)Fig.1 Phylogenetic tree constructed gene sequence diagram of F1(10×40)

2.1.2 菌株生理生化實驗結(jié)果 分離的菌株的糖發(fā)酵、碳源與氮源同化以及對高濃度D-葡萄糖生長測定等實驗結(jié)果見表1和表2。根據(jù)酵母菌的特征與鑒定手冊,分離的F1菌株發(fā)酵50%葡萄糖,不發(fā)酵半乳糖、棉籽糖、纖維二糖,脲酶實驗陰性,不能分解尿素,不能利用重氮基藍(lán)B、硝酸鹽、檸檬酸、L-賴氨酸,與接合酵母屬的生理生化特征相似。

表3 MRS培養(yǎng)基中菌落特征、革蘭氏染色、過氧化氫實驗結(jié)果Table 3 Morphological characteristics of colonies,the results of catalase hydroxide assay

注:+,≥90%菌株為陽性;-,≥90%菌株為陰性,表4～表6同。

表1 F1菌株糖類發(fā)酵的實驗結(jié)果Table 1 Result of sugar fermentation test by F1 strain

注:“+”表示發(fā)酵;“-”表示不發(fā)酵。

表2 F1菌株碳源和氮源同化的實驗結(jié)果Table 2 Result of carbon assimilation and nitrogen assimilation by F1 strain

注:“+”表示陽性;“-”表示陰性。

2.1.3 菌株26S rDNA的D2序列 以F1菌株的基因組DNA作為模板,進(jìn)行D2序列擴增測序后,將該基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行Blast比對發(fā)現(xiàn),F1的D2基因序列Zygosaccharomycesrouxiistrain(KC146358.1)的D2基因序列具有高度同源。從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取7株Zygosaccharomyces屬具有代表性的菌株,以D2基因序列同源性為基礎(chǔ),結(jié)合采用DNAMAN和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,由下圖2可知,供試菌株與Zygosaccharomycesrouxiistrain(KC146358.1)具有相似的遺傳性。綜合菌株形態(tài)特征,將F1菌株鑒定為Zygosaccharomycesrouxii。

圖2 F1菌株基因序列發(fā)育樹構(gòu)建圖Fig.2 Phylogenetic tree constructed gene sequence diagram of F1

國內(nèi)外也有對不同粉源的蜂糧的酵母菌鑒定的相關(guān)報道。Chevtchik[6]研究花粉中的微生物時發(fā)現(xiàn)含有酵母菌的存在;Gilliam從杏仁花粉和1、3、6周杏仁蜂糧中分離了130種酵母,分屬7個屬[15]。賀春玲等從長木蜂芍藥蜂糧中分離出酵母17株[16]。然而目前,在蜂糧微生物的研究中未見枇杷花蜂糧酵母菌的研究報道。本研究從重慶云陽地區(qū)枇杷花蜂糧中分離得到1株酵母菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化實驗及分子生物學(xué)方法鑒定為魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii),在以往研究中未見報道,魯氏酵母在醬油發(fā)酵過程中比較常見[17],發(fā)酵后揮發(fā)性成分的種類及含量增加,醬油香氣大大增強,能全面提高醬油的風(fēng)味及檔次[18-19],但是魯氏酵母在蜂糧中被發(fā)現(xiàn)還屬首次,擴寬了該菌種的實際實用范圍。

2.2 細(xì)菌分離

2.2.1 枇杷花蜂糧細(xì)菌分離結(jié)果

2.2.1.1 細(xì)菌形態(tài)特征、革蘭氏染色與過氧化氫反應(yīng) 為了更好地研究蜂糧發(fā)酵過程中其他細(xì)菌對其的影響,利用三種培養(yǎng)基對你進(jìn)行培養(yǎng),并分離純化。經(jīng)分離純化培養(yǎng),在MRS培養(yǎng)基上共分離出2種細(xì)菌,標(biāo)記為MRS1,MRS2;在MC培養(yǎng)基上共分離出1種細(xì)菌,標(biāo)記為MC1;在LB培養(yǎng)基共分離出2種菌,標(biāo)記為LB1,LB2。由表3可見,從三種培養(yǎng)基中分離出來的5種菌種,在革蘭氏染色實驗中均為陽性結(jié)果,從過氧化氫酶反應(yīng)呈現(xiàn)陰性結(jié)果,表明蜂糧中分離出的細(xì)菌為球菌[20]。

2.2.1.2 生理生化反應(yīng)、乳酸菌套裝生化鑒定管實驗結(jié)果 為了進(jìn)一步的研究所提取的菌種的性狀,我們通過生理生化反應(yīng)與乳酸菌套裝生化鑒定管對其進(jìn)行了深入研究。實驗將分離出的5株無芽孢、革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶反應(yīng)陰性的球菌進(jìn)行屬的鑒定,Lactococcuslactissubsp.1actis3株,Enterococcusdurans2株,結(jié)果如表4所示。

菌株MRS2、MC1、LB1不運動,在10℃生長,45℃不生長,6.5% NaCl不生長,葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)氣,鑒定為Lactococcus。糖發(fā)酵實驗中,發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、水楊苷、乳糖、七葉苷,不發(fā)酵阿拉伯糖、纖維二糖、甘露醇、棉籽糖、山梨醇和木糖,不液化明膠、產(chǎn)生吲哚,鑒定為乳酸球菌屬Lactococcuslactissubsp.lactis。

菌株MRS1、LB2不運動,葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)氣,在10℃和45℃生長,生長于6.5% NaCl,鑒定腸球菌屬Enterococcus。糖發(fā)酵實驗中,發(fā)酵纖維二糖、麥芽糖、水楊苷、乳糖和七葉苷,不發(fā)酵阿拉伯糖、甘露醇、棉籽糖、山梨醇、蔗糖和木糖,鑒定為Enterococcusdurans。

表4 生理生化反應(yīng)與乳酸菌套裝生化鑒定管實驗結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical reactions and biochemical identification of lactic acid bacteria suit tube experiments

2.2.2 油菜花蜂糧細(xì)菌分離結(jié)果

2.2.2.1 細(xì)菌形態(tài)特征、革蘭氏染色與過氧化氫反應(yīng) 經(jīng)過分離純化培養(yǎng),MRS培養(yǎng)基總共分離出3種細(xì)菌,記為MRS3,MRS4,MRS5;MC培養(yǎng)基總共分離出1種細(xì)菌,記為MC2;LB培養(yǎng)基總共分離出3種菌,記為LB3,LB4,LB5。由表5可見,從三種培養(yǎng)基中分離出來的7種菌種,在革蘭氏染色實驗中均為陽性結(jié)果,過氧化氫酶反應(yīng)陰性結(jié)果,所分離的菌種均為乳酸桿菌屬。

2.2.2.2 生理生化反應(yīng)與乳酸菌套裝生化鑒定管實驗結(jié)果 通過形態(tài)特征及革蘭氏染色和過氧化氫實驗,我們基本確定了所分離的菌種的基本類型,為了進(jìn)一步的分析所分離菌種的準(zhǔn)確信息,將分離到的菌株進(jìn)行糖發(fā)酵實驗,參照《乳酸菌細(xì)菌分類鑒定與實驗方法》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行種的鑒定,完成生理生化和乳酸菌套裝生化鑒定管實驗。實驗將分離到的7株無芽孢革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性、不還原硝酸鹽、不液化明膠、不產(chǎn)生吲哚和H2S、不運動的桿菌鑒定為乳酸桿菌屬Lactobacillus,結(jié)果如表所示。

表5 MRS培養(yǎng)基中菌落特征、 革蘭氏染色、過氧化氫實驗結(jié)果Table 5 Morphological Characteristics of Colonies, the Results of Catalase Hydroxide Assay

菌株MRS3、MC2、LB3、LB4發(fā)酵七葉苷、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖和海藻糖,發(fā)酵葡萄糖、乳糖都不產(chǎn)氣,不發(fā)酵阿拉伯糖和甘露醇,15℃ 不生長,鑒定為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum。

菌株MRS4、MRS5、LB5,發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨糖、麥芽糖、甘露糖和海藻糖,發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)氣,不發(fā)酵棉籽糖、木糖和七葉苷,15℃生長,鑒定為鼠李糖乳桿菌Lactobcacillusrhamnosus。

表6 生理生化反應(yīng)與乳酸菌套裝生化鑒定管實驗結(jié)果:Table 6 Physiological and biochemical reactions and biochemical identification of lactic acid

經(jīng)實驗鑒定分析,枇杷花蜂糧中3株乳酸菌都為乳酸球菌屬(Lactococcuslactissubsp.lactis),2株細(xì)菌為腸球菌屬(Enterococcus);油菜花蜂糧中7株乳酸菌中,有4株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),3株為鼠李糖乳桿菌(Lactobcacillusrhamnosus),兩種蜂糧中均分離出了乳酸菌。蜂糧中的乳酸菌在釀制初期大量產(chǎn)生代謝產(chǎn)物乳酸,使發(fā)酵環(huán)境的pH下降,有效的抑制了其他微生物的生長繁殖,因而降低了蜂糧中有害菌種的含量,使得蜂糧產(chǎn)品變得有益于人體消化吸收。同時,由于蜂糧中還有大量有益于人體的乳酸菌,可以調(diào)節(jié)人體中的微生物環(huán)境,平衡腸道菌群[21]。

目前國內(nèi)也有對不同粉源的蜂糧的乳酸菌鑒定的相關(guān)研究。蘇松坤等對茶花粉、茶蜂糧微生物進(jìn)行了研究,分離并鑒定出12種細(xì)菌,其中含有8種乳桿菌,1種乳球菌[22];賀春玲等從長木蜂芍藥蜂糧中分離出43株細(xì)菌中含有乳酸菌[16]。然而目前,在蜂糧微生物的研究中未見枇杷花和油菜花蜂糧微生物的研究報道。

蜂糧中細(xì)菌主要有三種來源途徑:第一,蜂糧的主要原料是蜂蜜和蜂花粉,所以蜂糧中的細(xì)菌有一部分來源于此。蜂蜜是蜜蜂吸食花蜜制成,蜂花粉也是蜜蜂采集花粉而成。這些原料必然是細(xì)菌的良好載體,在蜜蜂采集的過程中,隨之轉(zhuǎn)移到蜂糧中;第二,枇杷花蜂糧的釀制也有蜜蜂的參與,蜜蜂將蜂花粉咬碎,并吐出自己的分泌物,使其混勻后密封發(fā)酵?，F(xiàn)早已有研究[23-24]報道稱,在蜜蜂的消化道中存在著很豐富的生物菌群,所以,會有些細(xì)菌通過蜜蜂的分泌物轉(zhuǎn)移到蜂糧中;第三,蜂糧的釀制是在蜂房中完成的,蜜蜂的蜂巢是微生物的良好聚集地和很好的生存空間。所以在蜜蜂將蜂花粉搬運回巢,準(zhǔn)備釀制蜂糧時,蜂房中的細(xì)菌也會隨之進(jìn)入蜂糧中。

3 結(jié)論

本研究對重慶云陽地區(qū)枇杷花和油菜花蜂糧為樣品,采用孟加拉紅培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基,分離得到1株酵母菌,10株乳酸菌,2株腸球菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化實驗及分子生物學(xué)方法鑒定其屬種。其中酵母菌鑒定為魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii),枇杷花蜂糧中3株乳酸菌都為乳酸球菌屬(Lactococcuslactissubsp.lactis),2株細(xì)菌為腸球菌屬(Enterococcus);油菜花蜂糧中7株乳酸菌中,有4株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),3株為鼠李糖乳桿菌(Lactobcacillusrhamnosus)。在本實驗的后續(xù)研究中將以分離得到的酵母菌、乳酸菌作為接種微生物發(fā)酵蜂糧,對發(fā)酵蜂糧的發(fā)酵條件及品質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。本文首次利用重慶地區(qū)蜂糧為樣品分離其菌種,分離出的菌株均是首次在枇杷花蜂糧和油菜花蜂糧發(fā)酵環(huán)境中發(fā)現(xiàn),這為蜂糧發(fā)酵提供了重要的理論依據(jù),也對蜂糧產(chǎn)品的大批量生產(chǎn)起到重要作用。

[1]Takeshi Nagai,Toshio Nagashima,Takao Myoda,et al. Preparation and functional properties of extracts from bee bread[J]. Food/Nahrung,2004,48(3):226-229.

[2]Christopher O’Toole,Anthony Raw. Bees of the World[M].Blandford Press,1991.

[3]HL Foote. Possible use of microorganisms in synthetic bee bread production[J]. Am Bee J,1957,97:476-478.

[4]Carl Hayden. Microbiology of pollen and bee bread[J]. The Genus Bacillus,1979,10(3):269-275.

[5]黃文誠. 微生物對蜂群營養(yǎng)和健康的重要性(二)[J]. 中國蜂業(yè),2010,5:038.

[6]V Chevtchik. Mikrobiologie pyloveho kvaseni[J]. Publ Fac Sci Univ Masaryk,1950,323:103-130.

[7]嵇保中,劉署雯,徐麗娜,等. 蜂糧研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報,2006,22(8):165-169.

[8]孫崇臻. 枇杷蜜中酚類,脫落酸,蛋白質(zhì)的檢測及其指紋圖譜的研究[D].廣州:暨南大學(xué),2013.

[9]汪修建. 黃山枇杷中蜂蜜[J]. 中國養(yǎng)蜂,2005,56(2):29-29.

[10]張堅,劉鳳云,康勝利,等. 青海油菜花蜂王漿營養(yǎng)成分的研究[J]. 蜜蜂雜志,1994,3:12-14.

[11]張慧杰,玉柱,王林,等. 青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選[J]. 草地學(xué)報,2011,19(1):137-141.

[12]嚴(yán)萍,張永輝,烏斯?jié)M,等. 飼料玉米中優(yōu)質(zhì)乳酸菌的分離和鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(10):5926-5928.

[13]馬霞,王瑞明,關(guān)鳳梅,等. 細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株的分離和菌種初步鑒定[J]. 工業(yè)微生物,2005,35(3):23-26.

[14]唐玲,劉平,黃瑛,等. 酵母的分子生物學(xué)鑒定[J]. 生物技術(shù)通報,2008(5)：84-87.

[15]Martha Gilliam. Microbiology of pollen and bee bread:the yeasts[J]. Apidologie,1979,10(1):43-53.

[16]賀春玲,張淑霞,嵇保中,等. 長木蜂蜂糧中微生物豐度及抑菌活性菌株的篩選[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報,2012,34(3)：302-309.

[17]Steinhaus P,Schieberle P. Characterization of the key aroma compounds in soy sauce using approaches of molecular sensory science[j]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(15):6262-6269.

[18]趙梅,冷云偉,唐勝柏,等. 芳香性微生物在醬油中的應(yīng)用[J]. 中國調(diào)味品,2009,34(6):64-67.

[19]Petra Steinhaus,Peter Schieberle. Characterization of the key aroma compounds in soy sauce using approaches of molecular sensory science[J]. Lournal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(15):6262-6269.

[20]東秀株,蔡妙英. 常見細(xì)菌鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[21]蘇松坤,陳盛祿. 蜂糧中的細(xì)菌對 pH 的影響[J]. 中國養(yǎng)蜂,2002,53(2):4-5.

[22]蘇松坤,陳盛祿,余旭平,等. 花粉和蜂糧中細(xì)菌的分離和鑒定[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2001,27(6):627-630.

[23]Martha Gilliam,Diane K Valentine. Bacteria isolated from the intestinal contents of foraging worker honey bees,Apis mellifera:The genus Bacillus[J]. Journal of invertebrate pathology,1976,28(2):275-276.

[24]Eva Forsgren,Tobias C Olofsson,Alejandra Vásquez,et al. Novel lactic acid bacteria inhibitingPaenibacillus larvaein honey bee larvae[J]. Apidologie,2009,41(1):99-108.

包裝材質(zhì)翻新升級 可降解樹脂成新寵

包裝材質(zhì)的發(fā)展顯而易見，可降解樹脂因為概念新穎，成本下降，受到了包裝生產(chǎn)商的歡迎。

美國對塑料薄膜的需求將每年增長1.5%，至2018年達(dá)154億磅，市場價值約為249億美元。制造業(yè)產(chǎn)出和可支配收入的加速增長在多個市場為塑料薄膜帶來好兆頭。樹脂供應(yīng)量的上漲將使價格趨于穩(wěn)定，相比其他材料，塑料薄膜將更具成本競爭力。

LLDPE是使用量最大的薄膜樹脂，在2013年占總樹脂使用量的45%，至2018年，LLDPE將維持穩(wěn)定增長。市場分析師SpencerHobson發(fā)現(xiàn)，“LDPE薄膜的需求增長將較為緩慢，因為在一些領(lǐng)域，它被LLDPE薄膜所取代，而且LDPE薄膜的多個主要應(yīng)用市場已經(jīng)達(dá)到成熟?！?/p>

受生鮮農(nóng)產(chǎn)品和零食包裝的的推動，PP薄膜的需求增長率將高于平均水平。至2018年，HDPE薄膜預(yù)計增長率最低，因為盡管在食品包裝市場中的需求將會上漲，但一次性塑料袋用量的減少足以抵消這些增長。PET薄膜需求將接近平均增長水平，這種薄膜在食品包裝中的需求將大幅上升，但在磁帶和膠卷市場中的需求將下降。

非食品包裝領(lǐng)域帶來的競爭(比如藥品和醫(yī)用品)將抑制PVC薄膜的增長，致其增長水平低于平均。在所有的薄膜類型中，可降解樹脂的增長率將是最高的，因為這類樹脂的價格正逐步下降，受到包裝生產(chǎn)商的歡迎。

從需求領(lǐng)域而言，食品包裝市場將是薄膜需求增長最快的領(lǐng)域，很多食品都開始使用自立袋，以及活性和智能包裝。非食品領(lǐng)域?qū)Ρ∧ば枨蟮脑鲩L則主要來自藥品和醫(yī)用包裝。據(jù)弗里多尼亞集團(tuán)預(yù)測，非包裝類薄膜的需求增長預(yù)計較為遲緩，因為塑料袋應(yīng)用市場已經(jīng)成熟，而膠卷和磁性薄膜的市場需求也在下降，建筑薄膜的強勁增長并不足以彌補非包裝類薄膜在這些應(yīng)用中的下滑。次級包裝的增長也將較為緩慢，盡管制造業(yè)的反彈將促進(jìn)拉伸膜的需求，但服裝袋和零售產(chǎn)品包裝袋的需求將持平或出現(xiàn)負(fù)增長。

來源：慧聰食品工業(yè)網(wǎng)

Isolation and identification of microbe in loquat flowerand rape flower bee bread

DUAN Chuan-ren1，BAO Jia-fang1，SHI Yi-song1，XIA Xiao-hua2，NIE Lei1，F(xiàn)ENG Yong-fen1，MA Yun-xia1，SHANG Ya-ning1

(1.College of Bioengineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China;2.Fungood Meidi Ecological Breeding Limited Company,Chongqing 400044,China)

With the methods of morphology,physiology and biochemistry,26S rDNA sequence homology analysis and phylogenetic tree,strains from Chongqing Yunyang loquat flower and rape flower bee bread were identified.The results showed that:yeast strains separated from the loquat flower bee bread had high homogeneity withZygosaccharomycesrouxiistrain(KC146358.1),which were determined to beZygosaccharomycesrouxii. Through morphological and physiological identification,three of the five strains separated from the bee bread of loquat flower were identified asLactococcuslactissubsp.1actis,which were named MRS2,MC1,and LB1 and the other 2 strains wereEnterococcusduransnamed MRS1 and LB2. In the same way,four of the seven strains separated from the bee bread of rape flower were identified asLactobacillusplantarum,which named MRS3,MC2,LB3 and LB4. The other three strains wereLactobacillusrhamnosusnamed MRS4,MRS5 and LB5.The separation of these strains of provided scientific content for the research of bee bread microbial in Yunyang area and provides a choice of strains for the development of bee bread products.

bee bread;physiological and biochemical identification;yeast;lactic acid bacteria

2014-06-10

段傳人(1970-)，男，博士，副教授，研究方向：微生物資源開發(fā)及利用。

重慶科技攻關(guān)項目(2010GA811004)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)05-0175-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.028