劉淑貞,孫文靜,李成龍,周才瓊

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院暨重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715)

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微波殺青制備桑茶及其細(xì)胞抗氧化作用研究

劉淑貞,孫文靜,李成龍,周才瓊*

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院暨重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715)

以桑鮮葉為原料,采用微波殺青工藝制備桑茶,并通過(guò)建立細(xì)胞模型研究微波殺青桑茶不同溶劑提取物抗氧化作用。結(jié)果顯示:微波殺青桑茶不同溶劑提取物主要抗氧化成分多酚和黃酮類含量分別為26.53～37.67mg/g提取物和18.56～24.89mg/g提取物,細(xì)胞抗氧化活性大小為50%乙醇提取物>75%乙醇提取物>95%乙醇提取物>沸水提取物,且桑茶不同溶劑提取物的細(xì)胞抗氧化作用均存在劑量-效應(yīng)關(guān)系;顯著性分析表明50%～75%乙醇提取物細(xì)胞抗氧化能力顯著高于沸水提取物和95%乙醇提取物(p<0.05)。細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性與提取物中多酚類和黃酮類含量相關(guān)性較弱,相關(guān)系數(shù)分別為0.216、0.129。表明不能用多酚類和黃酮類含量來(lái)衡量桑茶提取物細(xì)胞抗氧化能力。

微波殺青,桑茶,細(xì)胞抗氧化作用

桑葉是一種藥食兩用天然植物資源,富含多酚類、黃酮甙、桑多糖及生物堿等生物活性物質(zhì)[1-2]。當(dāng)機(jī)體衰老或長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài),機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)多活性氧,可引起細(xì)胞的氧化損傷,進(jìn)而引發(fā)多種慢性疾病及炎癥。日常生活中多攝入一些天然抗氧化物質(zhì)有助于延緩衰老,預(yù)防慢性疾病。目前,多采用化學(xué)方法研究植物功能性成分的抗氧化作用[3-4],但化學(xué)方法不能模擬復(fù)雜的人體環(huán)境,抗氧化劑進(jìn)入人體后的代謝及生理活性會(huì)產(chǎn)生變化,因此不能確定抗氧化功能成分的體內(nèi)抗氧化能力及抗氧化機(jī)制。目前有報(bào)道采用細(xì)胞抗氧化評(píng)價(jià)體系來(lái)研究植物化學(xué)素的抗氧化能力[5-7]。

考慮桑葉功能成分特點(diǎn)、我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)桑葉的利用及茶飲在我國(guó)民間的普及,本研究擬采用桑鮮葉為原料制備桑茶。目前,桑茶加工常用的殺青方式有滾筒殺青和蒸汽殺青,這兩種殺青方式存在殺青時(shí)間長(zhǎng)、殺青不均等弊端。有研究發(fā)現(xiàn)采用微波殺青,具有升溫快、受熱均勻的特點(diǎn),可以快速鈍化鮮葉中酶的活性[8]。本實(shí)驗(yàn)采用微波殺青工藝制備桑茶,同時(shí)針對(duì)桑葉富含抗氧化成分多酚類物質(zhì)等特點(diǎn),對(duì)微波殺青桑茶不同溶劑提取物細(xì)胞抗氧化作用及與主要抗氧化成分多酚類相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

桑鮮葉及處理 西南大學(xué)桑園基地,選擇新鮮、成熟度適中、色澤光亮、深綠、無(wú)病蟲(chóng)害的完整桑葉為原料。將新鮮桑葉切分大小為3cm×2cm長(zhǎng)條形,以利后續(xù)揉捻成型。

新鮮雞血及處理 北碚天生市場(chǎng)購(gòu)買健康公雞,活體采血。取新鮮雞血10mL進(jìn)行連續(xù)的離心分離,用預(yù)冷的PBS沖洗,除去血漿、血小板、血沉黃層,得到的血紅細(xì)胞用PBS稀釋100倍。

1.2 試劑與儀器

茚三酮,丙酮、蔗糖、石油醚(60～90℃)、甲醇、三氯化鐵,三氯乙酸,過(guò)硫酸鉀,鐵氰化鉀,無(wú)水乙醇等 均為分析純;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司;2′,7′-二氯熒光二乙酸(DCFH-DA)、2,2,-偶氮異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)Sigma公司。

電子天平 上海精天電子儀器公司;722型分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;Synergy H4多功能熒光分析儀 德國(guó)BIO-TEK公司;臺(tái)式離心機(jī)TDLB80-2B 上海安亭科學(xué)儀器廠;超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微波殺青桑茶工藝處理 工藝處理[9-10]:將按1.1處理后的桑葉于25℃室溫下攤放,厚度1.5cm,每小時(shí)翻動(dòng)1次,攤放5h后取樣→微波殺青(微波功率300W,殺青時(shí)間2.5min,投葉量90g)→殺青葉在鐵鍋中揉捻,鍋內(nèi)溫度保持微熱→揉捻后的桑茶放入鼓風(fēng)干燥箱中干燥1.5h,干燥溫度108℃,每隔15min取出一次,在室溫下攤放10min。干燥和攤放交替進(jìn)行,直至桑茶含水量在10%以下。

1.3.2 桑茶不同溶劑提取物的制備及得率 微波殺青桑茶磨碎過(guò)40目篩,得桑茶粉,于-18℃冰箱中備用。

沸水提取物制備[11]:精確稱取桑茶粉10g于具塞三角瓶,加入150mL蒸餾水,100℃沸水提取30min,過(guò)濾,相同條件第二次提取,合并兩次濾液,真空濃縮后凍干。

不同濃度乙醇提取物的制備[12]:精確稱取桑茶粉10g置于具塞三角瓶中。提取條件料液比1∶15,60℃下提取30min,過(guò)濾后相同條件進(jìn)行第二次提取,合并兩次濾液,離心,提取液減壓真空濃縮至一定體積,經(jīng)冷凍干燥后得提取物。置于-18℃冰箱備用。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測(cè) 多酚類[13],黃酮類[14],可溶性糖[15],葉綠素[16]。

1.3.4 桑茶不同溶劑提取物細(xì)胞抗氧化作用 細(xì)胞模型測(cè)定桑茶不同溶劑提取物的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力(CAA-RBC)。

實(shí)驗(yàn)原理[5-7]:CAA-RBC法基本原理是利用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化。用抗氧化劑混合物及無(wú)熒光的DCFH-DA處理雞血紅細(xì)胞,二者進(jìn)入細(xì)胞后,在細(xì)胞酯酶的作用下,DCFH-DA被分解成還原型二氯熒光素(DCFH)。DCFH不能透過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞外。ABAP處理細(xì)胞,ABAP進(jìn)入細(xì)胞后自發(fā)降解形成過(guò)氧化自由基,從而誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧。細(xì)胞內(nèi)的DCFH極易被活性氧氧化成熒光物氧化型二氯熒光素(DCH),熒光物DCH可通過(guò)分光光度法測(cè)定?？寡趸瘎┠芙Y(jié)合細(xì)胞中活性氧,從而阻斷有綠色熒光的DCF生成。細(xì)胞熒光物質(zhì)的減少量能反映該化合物的抗氧化能力。熒光值越小,抗氧化劑抗氧化能力越高。

供試液配制:將1.3.2所得的提取物配制成濃度為20mg/mL的桑葉茶不同溶劑提取物。

DCFH-DA熒光探針工作液:用甲醇溶解DCFH-DA,配成濃度為5mmol/L的溶液,-20℃保存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)前用PBS進(jìn)行稀釋。

ABAP工作液:用PBS溶解ABAP,配成濃度為180mmol/L的溶液,-20℃保存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)前PBS進(jìn)行稀釋。

雞血紅細(xì)胞處理:按1.1方法得到血紅細(xì)胞。

取75μL細(xì)胞懸液,加入10μmol/L的DCFH-DA溶液和桑茶不同溶劑提取物溶液,37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。孵育結(jié)束后,用預(yù)冷的PBS溶液清洗細(xì)胞2次,充分去除細(xì)胞表面的樣品提取物和DCFH-DA。沖洗完成后在預(yù)冷的PBS中重新懸浮。然后轉(zhuǎn)移至96孔板中,在細(xì)胞懸液中加入ABAP工作液,使ABAP終濃度為300μmol/L,立即啟動(dòng)多功能酶標(biāo)儀,測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為485nm,發(fā)射波長(zhǎng)為580nm下的熒光值,每5min測(cè)定一次,測(cè)定50min,CK組用DCFH-DA和ABAP處理,不加桑茶提取物。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照。

細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性值(CAA)的計(jì)算:熒光值-時(shí)間曲線下的積分面積用origin 8.0軟件計(jì)算處理,按如下公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性值(CAA)。

式中:Area C表示空白對(duì)照組熒光值-時(shí)間曲線積分面積;Area T表示加入不同濃度桑茶提取物后的熒光值-時(shí)間曲線的積分面積;Area Q表示陽(yáng)性對(duì)照組熒光值-時(shí)間曲線的積分面積。

表1 微波殺青優(yōu)化工藝制備桑茶主要品質(zhì)成分(干基)Table 1 Analysis of main quality ingredients of mulberry tea by microwave fixation optimizing process(dry basis)

注：“-”表示文獻(xiàn)中沒(méi)有收錄。

表2 桑茶不同溶劑提取物抑制活性氧氧化DCFH的EC50Table 2 EC50 values of inhibiting ROS-induced DCFH oxidation by different solvents extracts of mulberry tea

注:字母不同代表本列數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(p<0.05);字母相同代表無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

表3 桑茶不同溶劑提取物多酚和黃酮含量及與EC50的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between contents of polyphenols and flavonoidsin different solvents extracts of mulberry tea and EC50 value

2 結(jié)果與分析

2.1 微波殺青制備桑茶主要品質(zhì)成分及抗氧化成分分析

經(jīng)對(duì)微波殺青工藝制備桑茶主要品質(zhì)成分進(jìn)行分析,結(jié)果如表1,桑茶葉綠素含量較高,遠(yuǎn)高于報(bào)道的綠茶葉綠素含量,構(gòu)成了桑茶湯清湯綠葉的基礎(chǔ),桑茶鮮、甜品質(zhì)成分游離氨基酸和可溶性總糖含量和報(bào)道的綠茶相當(dāng),表明桑茶茶湯鮮甜風(fēng)味和綠茶相當(dāng),而具有抗氧化作用及輕澀味感的多酚類含量則遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于綠茶,表明桑茶品質(zhì)特征為清湯綠葉及滋味鮮甜回甘。

2.2 微波殺青桑茶不同溶劑提取物的細(xì)胞抗氧化(CAA-RBC)能力

2.2.1 微波殺青桑茶不同溶劑提取物對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的影響 DCFA-DA工作液濃度的測(cè)定:選取一系列不同濃度的熒光探針工作液進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試,結(jié)果表明當(dāng)DCFH-DA濃度低于30μmol/L,熒光猝滅率高,不太穩(wěn)定;濃度高于100μmol/L,會(huì)減小實(shí)驗(yàn)的靈敏度,以50μmol/L的DCFA-DA溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為理想。

ABAP工作濃度的測(cè)定:適宜濃度的ABAP能夠?qū)CFH氧化成有綠色熒光的DCF,濃度太高會(huì)使生成的熒光太強(qiáng),濃度太低不能產(chǎn)生足夠的熒光強(qiáng)度。預(yù)實(shí)驗(yàn)中當(dāng)ABAP濃度為300μmol/L時(shí),桑茶不同提取物能夠使熒光值降到比較合適的水平。

血紅細(xì)胞中熒光強(qiáng)度的動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖1。桑茶不同溶劑提取物都能夠抑制DCF的熒光強(qiáng)度,且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系,在一定濃度范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度隨浸出物濃度的增加而減小。熒光強(qiáng)度越小,提取物的抗氧化能力越高,一定范圍內(nèi),抗氧化能力隨浸出物濃度的增加而增強(qiáng)。

圖1 桑茶不同溶劑提取物 對(duì)雞血紅細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of different solvents extracts of mulberry tea on fluorescence of Chicken red blood cells

2.2.2 微波殺青制備桑茶不同溶劑提取物EC50的計(jì)算 桑茶不同溶劑提取物的CAA值與其濃度的對(duì)數(shù)曲線如圖2。其細(xì)胞抗氧化活性大小為50%乙醇提取物>75%乙醇提取物>95%乙醇提取物>沸水浸出物,以沸水提取物細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性最小;顯著性分析表明50%～75%乙醇提取物細(xì)胞抗氧化能力顯著高于沸水提取物和95%乙醇提取物(p<0.05)(表2)。水和親水性有機(jī)溶劑乙醇提取能夠得到大部分植物化學(xué)成分,如多糖、生物堿、黃酮類、皂苷、蒽醌類等,同時(shí)不同濃度的乙醇具有不同的極性,提取物中輔助抗氧化的有效成分和含量有所不同,這些都將影響桑茶提取物的抗氧化能力。

圖2 桑茶不同溶劑提取物抑制活性氧氧化DCFH的 劑量效應(yīng)的對(duì)數(shù)回歸曲線Fig.2 Logarithm regression curves of dose-response of inhibiting ROS-induced DCFH oxidation by different solvents extracts of mulberry tea

2.2.3 微波殺青桑茶不同溶劑提取物多酚和黃酮含量與EC50的相關(guān)性分析 微波殺青桑茶不同溶劑提取物總酚和黃酮類含量見(jiàn)表3,經(jīng)對(duì)提取物中多酚和黃酮類化合物與其細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性的相關(guān)性分析顯示細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性與多酚和黃酮含量相關(guān)性較弱,相關(guān)系數(shù)分別為0.216、0.129。表明桑茶中重要的抗氧化成分多酚類物質(zhì)不是影響其細(xì)胞抗氧化能力的主要因素。

3 結(jié)論與討論

桑茶50%～75%乙醇提取物細(xì)胞抗氧化能力顯著高于沸水提取物和95%乙醇提取物(p<0.05),細(xì)胞抗氧化能力與提取物中主要抗氧化成分多酚類和黃酮類含量無(wú)相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.216、0.219。于善凱等[18]研究了不同品種杭白菊中酚類物質(zhì)含量和清除自由基活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)菊花中酚類物質(zhì)的含量高低與抗自由基活性強(qiáng)弱無(wú)明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。Velioglu等[19]對(duì)28種植物材料的抗氧化活性和其酚類含量進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者間沒(méi)有明顯相關(guān)性,并認(rèn)為是酚類以外的物質(zhì)在其抗氧化方面起主要作用。這表明不能用多酚類或黃酮類含量衡量桑茶提取物細(xì)胞抗氧化能力。這與劉瑞海等[20-21]報(bào)道沒(méi)食子酸、抗壞血酸、咖啡酸和兒茶酸的細(xì)胞抗氧化能力很弱,EC50分別是槲皮素的11、11.4、16、49倍,表兒茶素、花旗松素和阿魏酸的細(xì)胞抗氧化活性極低,無(wú)法計(jì)算EC50,染料木素、大豆苷元、芹菜素、柚皮素、柯因、蘆丁沒(méi)有細(xì)胞內(nèi)抗氧化性等有相似之處。同時(shí),有大量多酚及黃酮類等植物化學(xué)素具有較強(qiáng)的清除各種自由基等的報(bào)道[22-24]。這表明化學(xué)抗氧化能力很強(qiáng)的物質(zhì)不一定就能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)清除自由基,即單獨(dú)用化學(xué)抗氧化方法評(píng)價(jià)某物質(zhì)的抗氧化能力有誤差,建議通過(guò)建立細(xì)胞模型綜合評(píng)價(jià)食物的抗氧化性。

本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)低濃度桑茶提取物有促氧化活性,能刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS,氧化DCFH使其生成的綠色熒光增強(qiáng),甚至比只加入ABAP的空白對(duì)照的熒光值還要大,見(jiàn)圖1a;同時(shí),在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,其它三種溶劑提取物在低濃度時(shí)也能夠增大細(xì)胞內(nèi)熒光值,這說(shuō)明低濃度桑茶提取物有促氧化活性,可能桑茶提取物中富含的黃酮類化合物會(huì)刺激細(xì)胞內(nèi)與ROS有關(guān)的機(jī)制,或者被細(xì)胞內(nèi)的多酚氧化酶氧化產(chǎn)生H2O2,也有研究報(bào)道黃酮類物質(zhì)具有這種雙重特性[25-26],故研究細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力必須考慮劑量-效應(yīng)關(guān)系。

考慮本實(shí)驗(yàn)50%～75%乙醇提取物細(xì)胞抗氧化能力相對(duì)最佳,后續(xù)研究需要針對(duì)該提取物有關(guān)成分進(jìn)行分提并對(duì)其進(jìn)行深入研究。

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Study on the cell antioxidant activity ofmulberry tea by microwave fixation

LIU Shu-zhen,SUN Wen-jing,LI Cheng-long,ZHOU Cai-qiong*

(Engineering and Technology Research Centre of Characteristic Food & Food Science College,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Mulberry leaf is a kind of natural plant resources,which is rich in bioactive substance including polyphenols,flavonoid glycoside,polysaccharides and alkaloidals. Fresh mulberry leaves served as raw material to process mulberry tea by microwave fixation. The main quality and antioxidant ingredients including chlorophyll,free amino acids,soluble sugar,polyphenols and flavones of mulberry tea were analyzed. Cell antioxidant activity of different solvent extracts from mulberry tea by microwave fixation was investigated by establishing cell model in this experiment,which called CAA-RBC method for short. The contents of polyphenols and flavones of different solvent extracts of mulberry tea by microwave fixation were 26.53～37.67mg/g and 18.56～24.89mg/g,respectively. The ability of cell antioxidant activity of different solvent extracts of mulberry tea was 50% ethanol extract>75% ethanol extract>95% ethanol extract>boiling water extract and existed dose effect. Significance analysis showed that the cell antioxidant activity of 50%～75% ethanol extracts were higher than boiling water extract and 95% ethanol extract(p<0.05). The correlation between cell antioxidant activity and contents of polyphenols and flavones was weak. The coefficient correlation were 0.216,0.129,respectively. So the contents of polyphenols and flavones could not be measured cell antioxidant activity of extracts of mulberry tea.

microwave fixation;mulberry tea;cell antioxidant activity

2014-06-12

劉淑貞(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。

*通訊作者:周才瓊(1964-)，女，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。

TS272.5

A

1002-0306(2015)05-0103-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.013