李穎超,錢(qián) 和,孫秀蘭,汪何雅,崔 燕,杜 超,夏秀華

(江南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

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典型熱加工對(duì)花生致敏蛋白及其免疫反應(yīng)性的影響

李穎超,錢(qián) 和*,孫秀蘭,汪何雅,崔 燕,杜 超,夏秀華

(江南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)了花生制品加工過(guò)程中幾種典型熱加工方式對(duì)花生致敏蛋白的免疫反應(yīng)性的影響。結(jié)果表明:烘焙、水煮、油炸和高溫高壓處理均使花生可溶性蛋白含量顯著降低;隨之,處理后樣品中蛋白提取物的免疫反應(yīng)性也顯著下降,其中高溫高壓處理最為顯著;熱處理對(duì)花生致敏蛋白Ara h 2的溶解性及免疫反應(yīng)性的影響較小,而對(duì)Ara h1和Ara h 3的影響則比較明顯。

花生,過(guò)敏,致敏蛋白,免疫反應(yīng)性

花生是世界衛(wèi)生組織公布的8大食物致敏原之一,其引起過(guò)敏反應(yīng)的最小劑量非常低,安全劑量?jī)H為0.1mg,是蛋和奶的1/30,大豆的1/4000。另外,與蛋和奶等過(guò)敏原不同,花生過(guò)敏往往伴隨終生[1]。加拿大一項(xiàng)大型調(diào)查顯示,成人診斷明確的花生過(guò)敏率為1%,另有0.93%的調(diào)查對(duì)象為疑似對(duì)象[2]。在我國(guó),一項(xiàng)針對(duì)青島市過(guò)敏性疾病兒童的過(guò)敏原構(gòu)成研究顯示,超過(guò)40%的過(guò)敏體質(zhì)兒童對(duì)花生過(guò)敏[3]。在食物過(guò)敏引起的死亡病例中,過(guò)半是由花生引起。然而,花生又是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、具有香溢口感的大宗食品,它作為原料或配料廣泛用于生產(chǎn)各種加工食品。在花生的加工和烹調(diào)過(guò)程中,常常用到高溫加熱工藝,如水煮、烘烤、油炸、殺菌等。自1925年發(fā)現(xiàn)第一例花生過(guò)敏病例以來(lái),已有幾十種花生蛋白被指與花生導(dǎo)致的過(guò)敏有關(guān),但其中有11種(Ara h 1～11)被普遍認(rèn)可并正式命名[4]。這些致敏蛋白大多(Ara h 1～4,6,7)屬于種子貯藏蛋白,其中Ara h 1和 Ara h 2是主要致敏蛋白,能被95%的花生過(guò)敏患者血清所識(shí)別[5]。這些蛋白在食物的加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化,如展開(kāi)、聚集,以及化學(xué)修飾。這些變化導(dǎo)致花生致敏性的變化。目前,國(guó)內(nèi)有關(guān)加工方式對(duì)花生致敏性的研究十分鮮見(jiàn)。因此,本文將通過(guò)免疫學(xué)方法,對(duì)典型熱加工方式對(duì)花生致敏蛋白組分及其免疫反應(yīng)性的影響做初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C3H/HeJ小鼠(五周齡) 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;霍亂毒素(CT) Sigma;花生(紅皮) 購(gòu)于無(wú)錫市區(qū)超市;醋酸纖維膜(1.2μm) 德國(guó)Sartorius;TMB/DAB顯色液 上海生物工程有限公司;96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板 Costar;HRP標(biāo)記羊抗鼠IgE Southern Biotech 美國(guó);蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒 上海生物工程有限公司;其它常規(guī)試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生過(guò)敏小鼠模型的建立與血清的保存 方法參考文獻(xiàn)[6]，致敏:花生研磨成漿與CT混合,每只小鼠灌胃劑量為15mg花生(PN)與10μg CT;在第1、2、3d用花生漿液于CT的混合液連續(xù)灌胃3天,之后同樣配方灌胃,每周一次,連續(xù)3周。激發(fā):最后一次致敏后一周,小鼠空腹過(guò)夜,花生漿灌胃激發(fā)。灌胃劑量為每只小鼠30mg PN,分兩次灌胃。共設(shè)3組:空白組:蒸餾水;對(duì)照組:10μg CT;過(guò)敏組:15mg PN+10μg CT。激發(fā)后通過(guò)摘眼球取血獲得過(guò)敏小鼠血液,常溫下放置3 h后,4000×g離心10 min,血清析出,分裝后于超低溫冰箱(-76℃)保存。

1.2.2 花生的加熱處理 油炸(YZ):160℃花生油油炸5min;烘焙(HB):鼓風(fēng)干燥箱160℃,40min;水煮(SZ):100℃沸水20min;高溫高壓(GG):121℃,0.1MPa,30min。處理后將潮濕的樣品在30℃下干燥,水分含量低于6.0%。樣品置于-20℃保存。

1.2.3 花生總蛋白(PE)的浸提液的制備 選新鮮優(yōu)質(zhì)的花生仁,揉搓去除紅衣后在組織搗碎機(jī)中粉碎,過(guò)40目篩。再將花生粉與正己烷按1∶10(g/mL)混合,在4℃下磁力攪拌脫脂2h,靜置1h,棄去上清液,重復(fù)脫脂一次。將脫脂花生粉在通風(fēng)櫥中放置過(guò)夜,使正己烷揮發(fā)干凈。將脫脂后花生粉與預(yù)冷的0.01mol/L PBS(pH7.4,含0.01mol/L β-巰基乙醇和0.05% EDTA·2Na)1∶10(g/mL)混合,4℃下磁力攪拌過(guò)夜。次日將浸提液在4℃,11000×g離心30min,收集上清液,沉淀用浸提液再提取4h,離心后合并上清液,分裝后保存在超低溫冰箱(-76℃)。

1.2.4 樣品中可溶性蛋白的提取及其含量的測(cè)定 稱(chēng)取干物質(zhì)量為0.5g的樣品,加入0.01mol/L PBS(pH 7.4,含0.01mol/L β-巰基乙醇和0.05% EDTA·2Na)1∶10研磨浸提,在4℃下11000×g離心30min,收集上清液待用。將上清液梯度稀釋后按照說(shuō)明書(shū)(蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒)操作。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)體系SDS-PAGE垂直平板凝膠電泳,濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為12.5%,濃縮膠內(nèi)的電壓為80V,分離膠內(nèi)的電壓為120V。電泳后,考馬斯亮藍(lán)R-250染色、甲醇-冰醋酸脫色、凝膠成像得到電泳結(jié)果。低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量為14.4～97.4ku。樣品上清液與上樣緩沖液1∶4混合煮沸3～5min,上樣量為10μL。

為了調(diào)查油田方言的調(diào)值和歷史演變，采訪了三名不同年齡段的被試，三人都為本地常住居民，皆沒(méi)有長(zhǎng)期離開(kāi)居住地；年齡差異較明顯，三人的發(fā)音器官健康正常，沒(méi)有影響發(fā)音的缺陷，因此能夠代表油田話的發(fā)音人。表2是三位被試的具體信息。

1.2.6 免疫印跡(Western blotting)

1.2.6.1 電泳 SDS-PAGE電泳后,凝膠不染色,放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡至少5min。

1.2.6.2 轉(zhuǎn)膜(半干法) NC膜、濾紙和無(wú)紡纖維墊在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min,從陰極到陽(yáng)極,依次放置無(wú)紡纖維墊、三層濾紙、凝膠、NC膜、三層濾紙、無(wú)紡纖維墊,制作“三明治”電轉(zhuǎn)芯,期間用玻璃棒趕走氣泡,將其放入轉(zhuǎn)印槽,200mA轉(zhuǎn)膜70min。

1.2.6.3 封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,37℃下TBS漂洗3次,每次5min。漂洗后,加入封閉液,4℃過(guò)夜。

1.2.6.4 加一抗 TBST漂洗3次,每次5min。加入一抗(1∶10,過(guò)敏小鼠血清),在37℃孵育3h。

1.2.6.5 加二抗 TBST漂洗3次,每次5min,加入二抗(1∶2500,HRP標(biāo)記羊抗鼠IgE),37℃孵育2h;

1.2.7 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 1μg/mL的PE在4℃下包被過(guò)夜,洗滌后加入一抗(1∶10,過(guò)敏小鼠血清)與待測(cè)樣品液(稀釋3倍)的混合物(1∶1),37℃孵育1h孵育。再次洗滌3次,加入二抗(1∶2500,HRP標(biāo)記羊抗鼠IgE)37℃孵育1h孵育。再洗滌4次后,加入TMB顯色液,37℃孵育0.5h孵育。之后加入1mol/L的硫酸溶液終止反應(yīng),37℃孵育15min后立即在450nm下測(cè)定吸光度值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用EXCEL2003進(jìn)行均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算,結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,并采用SPSS13.0進(jìn)行Doucan’s多重檢驗(yàn)(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 可溶性蛋白含量

由圖1可見(jiàn),熱加工處理后的花生仁,其SPE的含量均顯著降低。烘焙處理和高溫高壓處理后,樣品中可溶性蛋白含量顯著降低,僅為對(duì)照的40%～45%,同時(shí)這兩個(gè)處理間無(wú)顯著性差異。水煮和油炸處理后,樣品中SPE含量的下降程度更大,僅為對(duì)照的23%～27%,且兩處理間也無(wú)顯著差異。熱處理可使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的改變。當(dāng)溫度高于70～80℃時(shí),其三級(jí)結(jié)構(gòu)將發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)變;當(dāng)溫度高于80～90℃時(shí),蛋白質(zhì)分子會(huì)發(fā)生分子內(nèi)或分子間相互作用,以及二硫鍵的重排;當(dāng)溫度達(dá)到90～100℃時(shí)蛋白質(zhì)分子就會(huì)發(fā)生聚集[7]。Schmitt等[8]同樣水煮、油炸和烘焙花生后,其可溶性蛋白含量發(fā)生明顯下降,且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)下降程度越大。Mondulet等[9]也得到相似結(jié)果,且烘焙處理的花生中的SPE含量為總蛋白含量的60%,而水煮花生中SPE含量更低(約為總蛋白含量的30%)。叢艷君[10]等學(xué)者的研究結(jié)果則表明,花生中SPE的含量受到加工方式和提取緩沖液的影響,尿素溶液的提取率最高,磷酸緩沖液提取率也較高,而檸檬酸、醋酸緩沖液提取效率較低,主要受pH影響。目前,花生致敏性研究中大多用pH為7.4的磷酸緩沖液。一方面是致敏蛋白提取率較為理想,另一方面使其活性保持較好。而不同處理對(duì)可溶性蛋白含量的影響主要是由處理溫度和時(shí)間的差異造成的。處理溫度越高,時(shí)間越長(zhǎng),蛋白質(zhì)發(fā)生變性和共價(jià)修飾的程度就高,其可溶性可能變化就越大。本研究中,油炸處理的溫度很高,且這種加工方式的熱傳遞速度很快,所以花生在較短時(shí)間就達(dá)到加工要求,嚴(yán)酷的處理?xiàng)l件是花生中可溶性蛋白含量顯著降低的一個(gè)因素。另外,水煮處理后花生中SPE含量也很低,這主要是由于花生中部分蛋白轉(zhuǎn)移到了處理水中,這在Schmitt 等和Mondulet 等的研究中都得以證實(shí)[8-9]。

圖1 熱加工處理對(duì)花生中可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of heat treatment on content of soluble proteins of peanut seeds

2.2 SDS-PAGE電泳

由圖2可以看出，花生經(jīng)熱處理后，蛋白質(zhì)提取物的電泳特征均發(fā)生了明顯變化。首先，處理后樣品蛋白提取物的電泳條帶較對(duì)照淺，這說(shuō)明處理后樣品的蛋白提取物含量有所下降，這與可溶性蛋白含量的變化結(jié)果一致。其次，分子量大約在66、31～43、20ku左右的6個(gè)條帶，不同處理的樣品這些條帶的變化不同。其中，烘焙和水煮樣品66ku的條帶較對(duì)照都明顯變窄，而高溫高壓和油炸處理的樣品該條帶幾乎看不到；油炸處理樣品31～43ku之間分子量較大的條帶與對(duì)照無(wú)明顯差異，而其他處理樣品該條帶皆明顯變淺；而31～43ku之間分子量較小的條帶除在烘焙處理樣品中有顯現(xiàn)痕跡外，其他處理樣品該條帶均沒(méi)有顯現(xiàn)；烘焙和水煮樣品中20ku左右的3個(gè)條帶較對(duì)照均無(wú)明顯變化，高溫高壓處理樣品未形成明顯條帶，而油炸處理樣品只剩其中較大和較小的2個(gè)條帶，中間1條帶消失。由此結(jié)果可得出，熱加工處理對(duì)樣品蛋白質(zhì)提取物中20ku左右的低分子量蛋白的影響較小，而對(duì)66、31～43ku分子量較大的蛋白影響比較明顯。這與其他研究學(xué)者的結(jié)果相似[8-9,11]。

圖2 熱加工處理后花生蛋白質(zhì)提取物的 SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Electrophoretic pattern of the protein extracts from different heated peanuts

2.3 ELISA和Western blotting

致敏原蛋白與特異性IgE的結(jié)合能力,即其免疫反應(yīng)性是反映致敏原蛋白激發(fā)能力的一個(gè)重要體外檢測(cè)指標(biāo)。本研究為了檢測(cè)熱加工處理后樣品可溶性蛋白提取物的與花生致敏蛋白特異性IgE的結(jié)合能力的變化,用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和Western blotting兩種方法從總IgE的結(jié)合能力和花生致敏原不同組分的IgE的結(jié)合能力進(jìn)行了分析。熱加工處理樣品可溶性蛋白提取物的IgE的結(jié)合能力均顯著低于對(duì)照,其中高溫高壓處理者最低(圖3a)。然而,這種降低并不能說(shuō)明加工一定會(huì)降低花生中致敏原蛋白的免疫反應(yīng)性。因?yàn)?熱加工處理使蛋白質(zhì)變性,樣品中可溶性蛋白含量降低。因此,本研究中處理后樣品的抑制率下降很大一部分原因是蛋白質(zhì)含量降低所致。國(guó)外大多學(xué)者研究表明,HB處理會(huì)增加花生的致敏性[9,11-12],并且認(rèn)為這種增加與美拉德反應(yīng)有密切關(guān)系[12-14]。同樣,油炸花生也會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)[9]。相反,水煮與高溫高壓處理的樣品,由于水的存在,美拉德反應(yīng)較弱,而樣品的免疫反應(yīng)性也有所降低[8-9,11,15]。水煮處理之所以降低花生致敏性是由于一部分致敏原在水煮過(guò)程中轉(zhuǎn)移到了處理用水中[10]。高溫高壓處理樣品的IgE的結(jié)合能力的下降主要?dú)w因于致敏蛋白結(jié)構(gòu)的改變,同時(shí)其致敏蛋白的消化穩(wěn)定性的降低也為其致敏性的下降提供了可能[15]。高溫高壓降低致敏蛋白的免疫反應(yīng)性的研究不僅僅局限于花生,在綠豌豆和羽扇豆的相關(guān)研究中也得到類(lèi)似結(jié)果[16-18]。但是,高溫高壓處理并不能降低杏仁和桃子中致敏原蛋白的IgE的結(jié)合能力[19-20]。綜上所述,濕熱處理可通過(guò)移除致敏原或改變其構(gòu)象而降低其免疫反應(yīng)性,為致敏性的降低提供了極大空間。但也并不適用于任何致敏原蛋白,需要進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 熱加工處理后花生蛋白質(zhì)提取物的 ELISA結(jié)果(a)和West blotting(b)Fig.3 The ELISA(a)and Western blotting performed on the protein extracts(b) from different heated peanuts

Ara h1和Ara h2是最重要的兩種致敏蛋白,其分子量分別為65和17～19ku,且前者占種子總蛋白的12%～16%左右[21]。Ara h 3也是一種比較重要的花生致敏原,其分子量在14～45ku[22]。本研究結(jié)果表明,熱加工處理對(duì)Ara h2的影響較小,而Ara h 3與IgE的結(jié)合則大大減少或檢測(cè)不到,尤其是高溫高壓處理后樣品中分子量較大的蛋白在SDS-PAGE和Western blotting中均未檢測(cè)到,同時(shí)油炸處理樣品中Ara h1也幾乎檢測(cè)不到;而烘焙和水煮處理樣品中Ara h1可明顯檢測(cè)到(圖3b)。由此可見(jiàn),熱加工處理后,花生中可溶性蛋白提取物樣品免疫反應(yīng)性的變化主要是由于Ara h1和Ara h3數(shù)量和IgE的結(jié)合活性的變化引起。同時(shí),高溫高壓處理是一種降低花生致敏性很具潛力的處理方法。

Beyer等認(rèn)為[11],水煮和油炸花生中Ara h1的顯著減少是樣品IgE的結(jié)合能力下降的主要原因,也是中國(guó)花生過(guò)敏人口較少(以水煮和油炸為主要食用方式)的原因。然而,Cabanillas等研究發(fā)現(xiàn)[15],熱處理后樣品中不溶性蛋白質(zhì)成分中致敏原含量很高。因此,目前的研究都是基于處理后可用緩沖液提取出來(lái)的部分蛋白質(zhì)的理化和生物特性而進(jìn)行的,而因?yàn)榧庸ぬ幚矶冃缘哪且徊糠值男再|(zhì)無(wú)法得以表征。近期的一些研究中,也有對(duì)不溶性部分做研究的結(jié)果[8,15],然而用于電泳實(shí)驗(yàn)的上樣緩沖液也并不能完全提取出所有致敏蛋白。因此,體外檢測(cè)食品的致敏性,尤其是在定量方面,局限性較大,需要尋求更加全面和說(shuō)服力的定量檢測(cè)方法。

3 結(jié)論

熱加工處理可顯著影響花生蛋白提取物中致敏原蛋白的含量和特性。由于熱變性花生提取物中致敏蛋白含量均顯著下降,其中Ara h1和Ara h3的變化較大,而Ara h2相對(duì)穩(wěn)定。水煮處理可使樣品中較多致敏蛋白溶于處理用水而移除致敏原;高溫高壓處理則通過(guò)改變致敏蛋白構(gòu)象,在降低花生致敏性方面具有一定潛力。

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Effect of thermal processing on the immunoreactive propertiesof allergenic proteins from peanut seeds

LI Ying-chao,QIAN He*,SUN Xiu-lan,WANG He-ya,CUI Yan,DU Chao,XIA Xiu-hua

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The aim of this study was to assess the effect of thermal processing on the IgE-binding capacity of whole peanut protein extracts. The results showed that:the content of soluble protein extracts was less marked in roasted,boiled,fried and autoclaved than in raw peanuts,and the IgE immunoreactivity of processed peanuts also decreased significantly,especially of autoclaved peanuts. The immunoreactive properties of allergens(Ara h1,Ara h2 and Ara h3)were altered by heat treatment and in particular of Ara h1and Ara h2.

peanut;allergy;allergenic protein;immunoreactivity

2014-05-14

李穎超(1984-),女,博士,研究方向:食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

*通訊作者:錢(qián)和(1962),女，博士，教授，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2011BAK10B03);江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(1026010241120600)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)05-0095-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.011