孔 琪,玉秋萍,王家勝,何磊磊,張 妮,余正文

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550001)

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不同二氫楊梅素含量的顯齒蛇葡萄提取物的抗菌活性與清除DPPH自由基能力研究

孔 琪,玉秋萍,王家勝,何磊磊,張 妮,余正文*

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550001)

研究不同二氫楊梅素含量的顯齒蛇葡萄提取物的抗菌活性與清除DPPH自由基能力。選取17種二氫楊梅素含量不同的顯齒蛇葡萄,使用乙醇超聲輔助法獲得各個(gè)樣品的提取物;采用藥敏濾紙片法和二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)體系分別研究提取物以及相同含量的二氫楊梅素純品的抗菌活性和清除DPPH自由基能力。結(jié)果表明:17種提取物的抗菌活性和清除DPPH自由基能力隨著提取物中二氫楊梅素含量的增加而增強(qiáng),提取物的抗菌活性和清除DPPH自由基能力顯著強(qiáng)于相應(yīng)含量二氫楊梅素純品。在10mg/mL濃度下,部分提取物的抑菌活性強(qiáng)于二氫楊梅素;對(duì)DPPH·清除作用:二氫楊梅素大于全部樣品;樣品10～17大于VC;樣品2～17大于BHT。

顯齒蛇葡萄提取物,二氫楊梅素,抗菌活性,清除DPPH·

顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)是葡萄科蛇葡萄屬的一種多年生藤本植物,俗稱“藤茶”“霉干茶”“白毛猴”等,主要分布于江西、湖南、廣東、廣西、重慶、貴州、湖北等省區(qū)[1]。顯齒蛇葡萄葉中的主要活性成分為黃酮類化合物[2],還含少量蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、揮發(fā)性成分、鞣質(zhì)、萜類、蒽醌類、有機(jī)酸及甾體和其他物質(zhì)。黃酮類化合物其主要包括二氫楊梅素(Dihydromyricetin)、楊梅素(Myricetin)、槲皮素(Quercetin)等[2],其中二氫楊梅素含量高達(dá)39.50%[3]。此類物質(zhì)具有抗菌、抗氧化、消炎、抗腫瘤等多種功效[4-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)所用植物材料[3](如表1所示)于2013年5月份采自全國(guó)不同地區(qū),均為單株顯齒蛇葡萄的葉子,葉子經(jīng)60℃烘干,粉碎,過(guò)40目(0.42mm)篩。

1.1.2 菌種 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus) 由上海順勃生物工程技術(shù)有限公司購(gòu)得;大腸埃希菌(Escherichiacoli)、綠膿桿菌(p.aeruginosa)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 貴州師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基:細(xì)菌培養(yǎng)基,具體制備參考文獻(xiàn)[14]。

1.1.3 藥品與試劑 二氫楊梅素 本實(shí)驗(yàn)室自制,含量≥98%;DPPH·樣品 Sigma公司;抗壞血酸(VC)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、二甲基亞砜(DMSO)、70%乙醇 均為分析純。

1.1.4 儀器 DH6000恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司;ASV-3023高壓滅菌器 北京醫(yī)訊成科技有限公司;SW-CJ-ZF型雙人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州江東精密儀器有限公司;TS-2102C恒溫?fù)u床 常州諾基儀器有限公司;BCD-221CHFA電冰箱 合肥美菱股份有限公司;752E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 天津普瑞斯儀器有限公司;EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1001V 上海愛(ài)朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 待測(cè)液制備 準(zhǔn)確的稱取17種顯齒蛇葡萄粉末各200mg,用15mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡1h之后進(jìn)行超聲提取。100kHz超聲輔助法超聲60min,得到濾液。重復(fù)提取3次,將所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,得到提取物粗品,準(zhǔn)確稱量(如表1所示),用二甲基亞砜配制成10.0mg/mL的待測(cè)液,根據(jù)用樣量和已知顯齒蛇葡萄中的二氫楊梅素含量及提取物粗品重量,計(jì)算出所配待測(cè)液的二氫楊梅素濃度(如表1所示)。二氫楊梅素純品(含量≥98%)用二甲基亞砜配制成濃度梯度為1.0～10.0mg/mL的溶液作為對(duì)照品。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 含菌平皿制備 參考文獻(xiàn)[15]將菌種活化到制備好的試管斜面上在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將在瓊脂培養(yǎng)基斜面上活化的細(xì)菌分別挑取一個(gè)環(huán)于裝有50mL的液體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi),在恒溫37℃的搖床上180r/min振蕩培養(yǎng)18h。采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)搖好的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù),把上述菌液分別用滅菌生理鹽水配制成106～107cfu/mL的菌懸液。取上述配制好的菌懸液0.2mL接種于培養(yǎng)皿內(nèi),用滅菌的涂布棒均勻涂布。

1.2.2.2 抑菌圈的測(cè)定 采用濾紙片擴(kuò)散法[14]。將濾紙用打孔器打成直徑為7mm的圓紙片,121℃干熱滅菌20min后,將小圓片貼于含菌平皿上,每個(gè)平皿三片,為三次重復(fù)。取1.2.1所配制的10.0mg/mL待測(cè)液25μL加于濾紙片上。以濃度梯度為1.0～10.0mg/mL的二氫楊梅素純品溶液為對(duì)照。以只加二甲基亞砜溶液的平皿為空白對(duì)照。將細(xì)菌平皿置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。取出觀察,采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小,重復(fù)3次取平均值。

1.2.3 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 DPPH·清除劑制備 將待測(cè)液用70%乙醇按照10倍稀釋法稀釋到1000倍(即將10mg/mL稀釋為10μg/mL)待用。二氫楊梅素純品用70%乙醇配制成濃度梯度1.0～10.0mg/mL溶液,用10倍稀釋法稀釋到1000倍待用。VC和BHT配制方法同二氫楊梅素,作為對(duì)照。

1.2.3.2 DPPH·清除率測(cè)定方法 參考文獻(xiàn)[13]并改進(jìn)。在5mL離心管中依次加入0.08mg/mL的DPPH·溶液(準(zhǔn)確稱取20mg DPPH,加70%乙醇溶解于小燒杯中,移至250mL容量瓶,定容)和70%乙醇各2mL,混勻反應(yīng)穩(wěn)定(約30min)后,以70%乙醇為對(duì)照,使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在λ=517nm處測(cè)吸光度,記為A1。將上述的DPPH·溶液換為稀釋的待測(cè)液,測(cè)得吸光度,記為A2。將上述70%乙醇換為稀釋的待測(cè)液,測(cè)得吸光度,記為A3。二氫楊梅素、VC和BHT測(cè)量如上取代待測(cè)樣液即可。計(jì)算自由基清除率(Y),公式為:

Y(%)=[1-(A3-A2)/A1]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藥敏濾紙片法測(cè)定抑菌圈結(jié)果顯示不同二氫楊梅含量提取物對(duì)五種細(xì)菌均具有抑菌作用,并隨著二氫楊梅含量的增加抑菌能力增強(qiáng)(如表2所示);二氫楊梅素對(duì)照品對(duì)五種細(xì)菌的抑菌作用隨二氫楊梅濃度增加而增強(qiáng)(如表3所示)。將表2和表3對(duì)比,用表2中的二氫楊梅素濃度小于1.0mg/mL的待測(cè)液抑菌圈與表3中的1.0mg/mL的二氫楊梅素抑菌圈比較,用表2中二氫楊梅素濃度小于2.0mg/mL的待測(cè)液抑菌圈與表3中的2.0mg/mL二氫楊梅素抑菌圈比較,以此類推。可以得出不同二氫楊梅含量的提取物抑菌能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其所含二氫楊梅素的抑菌活性。且當(dāng)二氫楊梅素的濃度與待測(cè)液濃度相等為10.0mg/mL時(shí),比較兩者抑菌活性,樣品8～17對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用強(qiáng)于二氫楊梅素;樣品9～17對(duì)表皮葡萄球菌的抗菌活性強(qiáng)于二氫楊梅素;樣品9、11～17種對(duì)大腸桿菌的抑菌活性強(qiáng)于二氫楊梅素;樣品11～17對(duì)綠膿桿菌的抑菌活性大于二氫楊梅素;樣品9～17對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌活性強(qiáng)于二氫楊梅素。

表1 實(shí)驗(yàn)所用樣品Table 1 Samples used in the experiments

表2 不同二氫楊梅素含量的提取物(10.0mg/mL)體外抑菌作用(抑菌圈直徑,mm)Table 2 In vitro inhibitory effect of extracts(10.0mg/mL)with different content of dihydromyricetin(inhibition zone diameter,mm)

注:*提取物配成10.0mg/mL待測(cè)液中二氫楊梅素濃度。

表3 二氫楊梅素的體外抑菌作用(抑菌圈直徑,mm)Table 3 In vitro inhibitory effect ofdihydromyricetin(Inhibition zone diameter,mm)

2.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同二氫楊梅含量的提取物對(duì)DPPH自由基都具有清除作用,且清除作用隨著所含二氫楊梅素量的增加而增強(qiáng)。二氫楊梅素、VC和BHT對(duì)DPPH自由基的清除作用隨著濃度的增加而增加(如表4所示)。用表4待測(cè)液中二氫楊梅素濃度小于2.0μg/mL樣品的清除率與2.0μg/mL二氫楊梅素純品的清除率比較,用待測(cè)液中二氫楊梅素濃度小于4.0μg/mL樣品的清除率與4.0μg/mL二氫楊梅素純品的清除率與比較,以此類推?？梢缘贸霾煌錀蠲泛康奶崛∥飳?duì)DPPH自由基清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其所含二氫楊梅素的清除能力。且當(dāng)二氫楊梅素、VC、BHT的濃度與待測(cè)液濃度相等為10.0μg/mL時(shí),比較對(duì)DPPH·清除作用:二氫楊梅素大于全部樣品;樣品9～17大于VC;樣品2～17大于BHT。

3 結(jié)論與討論

3.1 本文選用17種不同二氫楊梅素含量的顯齒蛇葡萄樣品,其中二氫楊梅素2.33%～38.20%相差很大。其原因可能是顯齒蛇葡萄分布地區(qū)較廣,不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄所含物質(zhì)種類和含量都具有一定的差異,這與品種、地區(qū)氣候、生長(zhǎng)時(shí)間、取樣部位等有一定的關(guān)系[3]。二氫楊梅素含量較低的樣品,提取物除二氫楊梅素外可能還有其他黃酮類、苷類、酚酸類、萜類等化合物[2],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不管提取物是與所含二氫楊梅素還是與等濃度二氫楊梅素純品做抗菌和清除DPPH自由基能力比較,其結(jié)果都存在一定的差異,之所以結(jié)果有差異就是提取物中的這些化合物與二氫楊梅素的綜合作用。但不可否認(rèn)二氫楊梅素是顯齒蛇葡萄提取物中的主要活性物質(zhì)。提取物的抗菌活性和清除DPPH自由基能力與其所含的二氫楊梅素含量是有相關(guān)性的,隨著二氫楊梅素含量的增加而增加。有些提取物中二氫楊梅素含量高的樣品抗菌活性甚至超過(guò)等濃度的二氫楊梅素,對(duì)DPPH自由基能力也強(qiáng)于等濃度的VC和BHT。

表4 不同二氫楊梅含量顯齒蛇葡萄提取物與二氫楊梅素、VC、BHT對(duì)DPPH 自由基的清除作用Table 4 The scavenging efect of extracts from Ampelopsis grossedentata with different contentof dihydromyricetin,different content of VC and BHT on DPPH·

注:*稀釋1000倍后待測(cè)液中二氫楊梅素濃度。

3.2 近年來(lái)二氫楊梅素作為天然抗菌抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品中,但二氫楊梅素屬于天然的黃酮類化合物,存在脂溶性和水溶性較差、生物利用率低、穩(wěn)定性不好等缺點(diǎn),而粗提物往往具有較高的溶解性,且可能具有更好的生物利用度。本實(shí)驗(yàn)證明顯齒蛇葡萄提取物也具有較好的抗菌和清除DPPH自由基活性,在以后的生產(chǎn)應(yīng)用中可以考慮直接使用提取物。

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Study on the antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability ofextracts fromAmpelopsisgrossedentatawithdifferent content of dihydromyricetin

KONG Qi,YU Qiu-ping,WANG Jia-sheng,HE Lei-lei,ZHANG Ni,YU Zheng-wen*

(School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)

The antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability of extracts of seventeenAmpelopsisgrossedentatasamples with different content of dihydromyricetin(DMY)were studied. The extracts were prepared from leaves ofA.grossedentataunder ultrasonic wave-assisted ethanol extraction,the inhibition zone method was used to study the antibacterial activity of extracts,and the DPPH· radical scavenging effect of extracts was investigated using UV spectrophotometer method. In the meantime,antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability of the contented DMY in extracts and the same concentration of standard DMY were determined to make comparisons. Results showed that all of these extracts had antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability,and the activities were enhanced with the increasing of DMY content in the extracts. The antimicrobial activitiy and scavenging DPPH· capability of extracts were significantly stronger than the same concentration of DMY. Under the concentration of 10mg/mL,some of the extracts expressed greater antibacterial activity than the same concentration of DMY,and for DPPH· scavenging capability,DMY has stronger than all extracts,extracts(No. 10～17)have better than VCand extracts(No. 2～17)have better than BHT.

extracts fromAmpelopsisgrossedentata;dihydromyricetin;antimicrobial activitiy;DPPH·

2014-05-14

孔琪(1989-),女,在讀碩士,研究方向:代謝組學(xué)。

*通訊作者:余正文(1973-)，男，博士，教授，研究方向：植物化學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31060056);國(guó)家自然科學(xué)基金(31460068)；貴州省科技基金項(xiàng)目(黔科合J字[2011]2368號(hào));貴州省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)(黔科中藥字[2011]5046號(hào))。

TS201.3

A

1002-0306(2015)05-0087-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.009