梁 瑞,孟宏濤,段 煒,王家林, 李戰(zhàn)寧，徐文煥

survivin在肝癌細胞株Hep G2表達與化療藥物敏感性的關(guān)系

梁 瑞1,孟宏濤2,段 煒2,王家林1, 李戰(zhàn)寧2，徐文煥3

目的 探討肝癌細胞株Hep G2中凋亡抑制因子survivin與化療藥物敏感性的關(guān)系。方法 通過MTT檢測肝癌細胞株Hep G2對于1.0 μg/ml順鉑, 1 μmol/L阿霉素，及1.0 μg/ml吉西他濱的敏感程度；通過Western blot 檢測Hep G2中survivin 蛋白在順鉑、阿霉素、吉西他濱處理后不同時間段表達水平的變化。結(jié)果 在藥物作用72 h后，10%～20%的肝癌細胞仍然存活并具有代謝活性。順鉑和吉西他濱處理48 h后survivin蛋白表達升高(2.04±0.05vs1.25±0.05；1.84±0.02vs1.25±0.05；1.92±0.05vs1.55±0.04；1.88±0.11vs1.55±0.04,差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)。阿霉素處理48 h后survivin 蛋白表達并未見明顯變化(1.73±0.11vs1.52±0.02；1.66±0.12vs1.52±0.02),差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 survivin 蛋白水平升高與肝癌細胞株Hep G2部分化療藥物敏感性相關(guān)。

肝癌;survivin;順鉑;吉西他濱;阿霉素

目前，全身化學(xué)藥物治療(化療)和動脈局部化療是肝癌治療的主要手段，但是對患者的生存率沒有明顯的提高，這可能與化療藥物對肝癌細胞的敏感性有關(guān)。越來越多的研究結(jié)果表明，化療藥物的敏感性與腫瘤細胞的抗凋亡能力密切相關(guān)[1]。survivin是目前最強的凋亡抑制因子，很可能與化療藥物的敏感性有一定的關(guān)系。筆者于2014-07至2014-09通過對比化療藥物處理前后肝癌細胞株Hep G2中survivin表達變化，旨在探討它與化療藥物敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細胞株和藥物濃度 人肝癌細胞株Hep G2，使用RPMI 1640培養(yǎng),含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，2 mmol/L谷氨酰胺。順鉑(江蘇豪森藥業(yè))、阿霉素(浙江海正藥業(yè))、吉西他濱(法國禮來制藥廠)均溶于無血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，分別配成1.0μg/ml順鉑、 1μmol/L阿霉素、1.0μg/ml吉西他濱。

1.2 細胞存活率檢測 細胞株Hep G2培養(yǎng)于含5%的CO2恒溫37 ℃培養(yǎng)箱，分別暴露于既定的化療藥濃度1、2、4、8、12、24、48、72 h。收獲的細胞通過四甲基偶氮唑鹽(methy thiazolyl tetrazoIium，MTT)方法來檢測細胞存活率。具體方法為：用0.25%的胰蛋白酶消化單層人肝癌細胞Hep G2，用無血清RPMI 1640配成單細胞懸液，以每孔1.5×103細胞種植在96孔板培養(yǎng)24 h。然后不同化療藥物處理1、2、4、8、12、24、48、72 h。在既定時間點每孔加入20 μl (0.5 mg/ml) MTT,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后去除MTT。加150 μl DMSO，振蕩10 min。選取490 nm波長在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測各孔光吸收值。實驗同時以不加藥物的無血清培養(yǎng)液為對照組，不加細胞只加無血清培養(yǎng)液為空白對照孔。以空白對照孔調(diào)零進行光吸收值測定，細胞存活率計算利用以下公式：細胞存活率=試驗組光吸收值(A)/對照組光吸收值(A)×100%。

1.3 Western Blot檢測 對于總蛋白提取，細胞懸浮于Western及IP細胞裂解液[20 mM Tris(pH 7.5)，150 mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin(購于Beyotime公司)。在4 ℃條件下14 000 r/min離心,共10 min。蛋白質(zhì)提取后，在做Western-blot實驗前，首先要對提取的蛋白質(zhì)進行定量。將所提取的蛋白質(zhì)樣品取2 μl，加在超微量紫外分光光度儀上，即可直接測定蛋白質(zhì)濃度，及260/280值。Western Blot實驗步驟簡述如下(1)上樣：用電泳緩沖液沖洗預(yù)制膠的孔道，保證每個泳道蛋白上樣量均為50 μg。(2)電泳。恒壓120 V，密切觀察標記條帶的位置，待survivin大約處于分離膠中下部時，停止電泳。(3)轉(zhuǎn)膜。電壓100 V轉(zhuǎn)膜90 min。在冰桶內(nèi)轉(zhuǎn)膜，用冰塊覆蓋。(4)封閉。加封閉液，室溫搖床封閉30 min。(5)加一抗。加survivin、GAPDH一抗，4 ℃過夜。(6)加二抗。羊抗兔IgG 1∶2000，室溫下?lián)u床孵育1 h。(7)掃膜。使用美國BIO-RAD凝膠呈像儀掃膜，保存圖像并用儀器自帶分析系統(tǒng)對目的蛋白條帶進行吸光度定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌細胞株Hep G2對不同化療藥物的敏感性 在藥物處理12 h內(nèi)凋亡細胞的百分比并無明顯改變。在順鉑、阿霉素和吉西他濱處理24 h后，肝癌細胞部分凋亡。暴露于這三種藥物48 h后細胞存活率顯著下降(均P<0.05)。培養(yǎng)72 h后，在順鉑、阿霉素處理組均有20%的肝癌細胞存活并具有代謝活性，吉西他濱處理組仍有>10%的肝癌細胞存活(圖1)。

圖1 順鉑、阿霉素、吉西他濱處理Hep G2細胞后細胞生存曲線

2.2 順鉑、阿霉素、吉西他濱處理后survivin 蛋白表達水平的變化 1 μmol/L阿霉素，1 μg/ml順鉑和1.0 μg/ml吉西他濱干預(yù)24 h， survivin蛋白表達并未見明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。1 μg/ml順鉑和1.0 μg/ml吉西他濱治療48、72 h后survivin 蛋白表達水平明顯高于未處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。但是,1 μmol/L阿霉素治療后，survivin蛋白表達并未見明顯升高(1.73±0.11vs1.52±0.02；1.66±0.12vs1.52±0.02)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2) 。

藥物survivin蛋白未處理組24h48h72h阿霉素1.52±0.021.61±0.051.73±0.111.66±0.12吉西他濱1.55±0.041.71±0.121.92±0.05①1.88±0.11①順鉑1.25±0.051.41±0.322.04±0.05①1.84±0.02①

注：與阿霉素相比，①P<0.05

3 討 論

survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，也是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子[2]，于1997年由耶魯大學(xué)Alfieri等用效應(yīng)細胞蛋白酶受體1(effector-cell protease receptor 1, ERP-1)在人類基因庫的雜交中分離獲得。survivin可以特異地與細胞凋亡蛋白caspase相結(jié)合，從而抑制細胞凋亡[3]。survivin在多種癌組織中高表達，并且對不良預(yù)后有一定的預(yù)測意義[4,5]。

圖2 阿霉素、吉西他濱、順鉑處理后survivin 蛋白水平的變化

本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞在1.0 μg/ml濃度順鉑、 1 μmol/L阿霉素及1.0 μg/ml吉西他濱處理后的survivin基因與蛋白的變化，表明不同藥物處理后凋亡細胞數(shù)量在處理12 h內(nèi)并無明顯改變，但在12～24 h，數(shù)量迅速增加。在培養(yǎng)72 h后，10%～20%的肝癌細胞仍然存活并具有代謝活性，表明延長這些藥物的暴露時間仍然不能徹底消除這些腫瘤細胞。逃脫凋亡的細胞可能對化療藥物敏感性降低。這與Portugal等[6]的研究結(jié)果一致，說明化療藥物通過誘發(fā)腫瘤細胞發(fā)生凋亡從而抑制腫瘤細胞生長并不能消除全部腫瘤細胞。

本研究通過觀察不同化療藥物處理肝癌細胞株Hep G2，逃脫凋亡的細胞中survivin的表達變化，發(fā)現(xiàn)順鉑和吉西他濱處理48 h后survivin 蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明暴露于順鉑和吉西他濱，肝癌細胞Hep G2通過高表達survivin以抵抗藥物的殺傷作用，從而降低化療藥物的敏感性。在胃癌中survivin的高表達抑制胃癌細胞的凋亡[7]。黃濤等[8]發(fā)現(xiàn)，survivin 蛋白在人肝癌多藥耐藥(MDR)細胞株Bel-7402/5-Fu中高表達。這些均與本研究結(jié)果一致。另外，有研究通過抑制survivin基因表達，發(fā)現(xiàn)能更好地抑制卵巢癌耐藥細胞株A2780-cp的生長,降低其耐藥性,促進其凋亡[9]，更加說明survivin抑制凋亡在化療藥物敏感性中具有重要的作用。

最近， LIU等[10]和李國權(quán)等[11]發(fā)現(xiàn)，通過siRNA抑制survivin基因的表達能夠提高對肺腺癌和HeLa細胞細胞化療藥及γ射線的敏感性,增加細胞凋亡，進一步說明survivin與化療藥物敏感性相關(guān)。本研究結(jié)果可為肝癌細胞化療藥物敏感性機制探討提供新的信息。

[1] 韓 杰,趙建輝,檀碧波，等.消化道腫瘤凋亡抑制蛋白表達與體外化療藥物敏感性的關(guān)系 [J].中華普通外科雜志，2009，24(2)：149-152.

[2] Altieri D C. Survivin, cancer networks and pathway-directed drug discovery[J]. Nat Rev Cancer，2008(1):61-70.

[3] 趙 禎,匡安仁. 凋亡抑制蛋白survivin研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2012，12(24)：4761-4764.

[4] 李 陽,王君霞,關(guān) 婷.宮頸癌中缺氧誘導(dǎo)因子-1的表達及臨床意義[J].華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2014，28(2)：140-141.

[5] 黃海東，李莉洋，郭 穎，等.PTEN和survivin基因在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中的表達及臨床意義[J].武警醫(yī)學(xué)，2014,25(1):24-25.

[6] Portugal J, Bataller M, Mansilla S.etal. Cell death pathways in response to antitumor therapy [J]. Tumori，2009，95(4):409-421.

[7] 馮 俊,吳云飛,徐慧綿.胃癌組織survivin基因上調(diào)對Caspase-3表達影響的相關(guān)性研究[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17(14):1083-1085.

[8] 黃 濤,楊盛力,尹太勇.Livin、survivin在人肝癌多藥耐藥細胞株中的表達及意義[J] 山東醫(yī)藥， 2011，5(11)：12-14.

[9] 黃佳佳,吳興龍,鄭 洪.RNAi雙向沉默survivin和XIAP基因?qū)β殉舶┘毎鸄2780-cp凋亡及順鉑敏感性影響的觀察 [J].中華腫瘤防治雜志，2011，18(10)：769-771.

[10] Liu J，Wang Yan，Jiang Ji，etal. Inhibition of survivin expression and mechanisms of reversing drug-resistance of human lung adenocarcinoma cells by siRNA [J].Chin Med J, 2010,123(20):290.

[11] 李國權(quán),雷宏偉,徐曉穎.靶向survivin基因siRNA對HeLa細胞放射敏感性的影響[J].中華腫瘤防治雜志,2010,17(6):427-429.

(2014-12-10收稿 2015-03-10修回)

(責任編輯 郭 青)

Relationship between changes of survivin expression and chemotherapeutic sensitivity in Hep G2

LIANG Rui1, MENG Hontao2, DUAN Wei2, WANG Jialin1, LI Zhanning2, and XU Wenhuan3.

1.Department of Hepatobiliary Chest Surgery, 2. Medical Service，Shaannxi Provincial Corps Horspital, Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054, China;3.Scientific Research Office, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China

Objective To investigate the relationship between survivin and chemotherapeutic sensitivity in hepatocellular carcinoma cells. Methods By the method of MTT, the sensitivity of Hep G2was tested to be 1.0 μg/ml cisplatin, 1 μmol/L doxorubicin and 1.0 μg/ml gemcitabine. Western blot was used to detect the expression of survivin protein at various time points after the drugs intervention. Results Cultured for 72 hours, 10-20% of Hep G2cells were still alive(2.039±0.05vs1.258±0.05；1.843±0.02vs1.258±0.05；1.924±0.05vs1.551±0.04；1.884±0.11vs1.551±0.04) ,P<0.05. After cisplatin and gemcitabine intervention for 48 hours, the expression of survivin was elevated (P<0.05). After adriamycin treatment for 48 hours, the expression of survivin protein had no significant change(1.729±0.11vs1.518±0.02；1.667±0.12vs1.518±0.02). Conclusions In Hep G2, the high expression of survivin is associated with the chemosensitivities of parts of drugs.

hepatoma; survivin; cisplatin; gemcitabine; doxorubicin

梁 瑞，碩士，主治醫(yī)師，E-mail:79669428@qq.com

710061 西安，武警陜西總隊醫(yī)院:1.肝膽胸外科，2.醫(yī)務(wù)處；3.100853 北京，解放軍總醫(yī)院科研處

徐文煥，E-mail:xuwenhuan999@126.com

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