劉艷環(huán)，李海濤，朱言柱，張潤祥，肖佳美，苗利光

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112)

抗菌肽是生物體抵御病原微生物入侵而產(chǎn)生的一種多肽類物質(zhì)，是生物先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。在各種動物、植物、細(xì)菌、真菌中廣泛存在[2，3]?？咕牟粌H具有殺菌作用，還具有抗病毒、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[4～8]。目前，抗菌肽已成為藥理學(xué)、生理學(xué)等領(lǐng)域和醫(yī)藥食品、臨床等行業(yè)的研究熱點?？咕牡淖饔冒悬c決定其抗菌方式和強度，不同種抗菌肽對細(xì)菌的作用機制不同[9～13]。前期研究中我們研制出一種理化性質(zhì)穩(wěn)定、體內(nèi)外抗菌活性較強的抗菌多肽MSL抗菌肽(以下簡稱MSL)[14，15]。本試驗通過抗菌肽作用于細(xì)菌后檢測胞外蛋白質(zhì)濃度的變化和通過透射電鏡對細(xì)菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的觀察研究，明確該種抗菌肽對細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷作用，為確定其作用靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗菌肽

MSL(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟動物疫病研究室研制，純度>95%)。

1.2 試驗菌株

金黃色葡萄球菌(CVCC26003，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；綠膿桿菌(PAK/2pfs，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所疫病研究室保存)。

1.3 主要試劑及儀器

BCA蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；透射電子顯微鏡(H7650，Hitachi公司)；酶標(biāo)儀(VERSA max，MolecylarDevices公司)。

1.4 MSL作用于細(xì)菌后胞外蛋白質(zhì)濃度的檢測與分析

分別將綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取菌液，5000r/min離心5min，棄上清，收集沉淀，用生理鹽水稀釋菌濃度至1×108個/mL，取制備好的菌液0.1mL至EP管中，加入MSL至終濃度為1×MIC，混勻，于37℃保溫孵育，分別于0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min、180min、240min離心收集上清液。用蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒檢測各時間點蛋白濃度，分析蛋白濃度變化規(guī)律。

1.5 MSL作用于細(xì)菌的透射電鏡觀察

分別將金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD 0.6～0.8)，取菌液，5000r/min離心10min，棄上清，收集沉淀，用10mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)沖冼2次，用PBS調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至1.5×108個/mL，將制備好的菌液取0.5mL至EP管中，然后加入純化的MSL至終濃度為1×MIC，混勻，于37℃保溫孵育60min，離心收集菌體，PBS緩沖液洗滌菌體3次。將適量無菌水加入菌懸液，調(diào)整細(xì)菌濃度至108個/mL。

取上述菌懸液與等量的2%磷鎢酸鈉水溶液在載玻片上混合染色30s。用無菌吸管吸取混合菌懸液滴在銅網(wǎng)膜上。經(jīng)2min～3min后，用濾紙吸去多余水分，待樣品干燥后，置低倍光學(xué)顯微鏡下檢查，選取菌體分布均勻的銅網(wǎng)作為觀察樣本，透射電鏡觀察分析樣本并記錄、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSL作用于細(xì)菌后胞外蛋白質(zhì)濃度的變化規(guī)律與分析

利用酶標(biāo)儀在562nm波長條件下檢測標(biāo)準(zhǔn)品及綠膿桿菌和葡萄球菌樣品各時間點的OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)品OD值及相應(yīng)濃度值做圖后，計算出樣品各時間點OD值對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度值。以蛋白質(zhì)濃度為Y軸、各時間點為X軸做圖，見圖1、圖2。

圖1 MSL作用于綠膿桿菌后胞外蛋白質(zhì)濃度的變化

Fig.1TheconcentrationofextracellularproteinofpseudomonasaeruginosawithMSL

圖2 MSL作用于金黃色葡萄球菌后胞外蛋白質(zhì)濃度的變化

Fig.2TheconcentrationofextracellularproteinofstaphylococcusaureuswithMSL

由圖可見，MSL與2種細(xì)菌接觸后可立即引起蛋白質(zhì)濃度提高，短時間內(nèi)又有所下降，反復(fù)幾次后蛋白質(zhì)濃度基本穩(wěn)定在明顯高于MSL未作用于菌體時的濃度值。可以確定，MSL可損傷細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)，引發(fā)胞液外流，蛋白質(zhì)濃度升高。胞液中除各種蛋白質(zhì)外，還含有各種酶和其他物質(zhì)，造成蛋白質(zhì)部分被分解，引起蛋白質(zhì)濃度發(fā)生上述變化。

2.2 MSL作用于細(xì)菌后的透射電鏡觀察分析結(jié)果

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，MSL對綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的破壞作用，正常對照組的細(xì)菌菌體表面超微結(jié)構(gòu)致密均勻，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)內(nèi)電子密度較高且均勻，菌體周圍菌毛層結(jié)構(gòu)完整、清晰。MSL在1個MIC濃度作用60min后，細(xì)菌細(xì)胞壁遭破壞，細(xì)胞壁和胞漿內(nèi)電子密度降低，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜剝離，呈現(xiàn)不規(guī)則的圓形凸起，菌毛結(jié)構(gòu)混亂，有的脫落，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部不均勻，染色質(zhì)聚集，嚴(yán)重者細(xì)胞崩解結(jié)構(gòu)不清(圖3、圖4)。

a.正常綠膿桿菌細(xì)胞；b、c.MSL作用后的綠膿桿菌細(xì)胞

a.正常金黃色葡萄球菌細(xì)胞；b、c.MSL作用后的金黃色葡萄球菌細(xì)胞

3 討論

抗菌肽因具有廣泛的生物學(xué)功能，特別是廣譜的抗菌功能而成為研究的熱點。目前，抗菌肽的抗菌機理仍然沒有研究清楚，原因是各種抗菌肽的抗菌方式不同。多數(shù)研究者認(rèn)為，抗菌肽主要是通過與細(xì)菌上的受體作用而發(fā)揮抗菌作用，如細(xì)菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA或RNA、菌體的功能蛋白等，其中對細(xì)胞膜的作用研究最清楚[10～14]。

本研究選取革蘭氏陰性細(xì)菌綠膿桿菌和革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌，研究MSL的作用靶點，分析該抗菌肽對革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的作用及作用差異。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MSL對革蘭氏陰性和陽性菌細(xì)胞膜均具有一定程度的破壞作用，并能作用于胞內(nèi)物質(zhì)引發(fā)染色質(zhì)聚集，對2種細(xì)菌損傷程度無明顯區(qū)別。

細(xì)菌細(xì)胞中存在多種蛋白酶，在細(xì)胞內(nèi)的分布有各自特定的區(qū)域，在細(xì)胞質(zhì)中含量最高，在細(xì)胞膜、周質(zhì)、外膜等也有分布。蛋白酶在細(xì)胞代謝中具有組成自身防御體系、降解無用蛋白質(zhì)等重要生理功能。本研究通過檢測標(biāo)準(zhǔn)品及被抗菌肽作用的綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌樣品各時間點的蛋白質(zhì)濃度發(fā)現(xiàn)，MSL與細(xì)菌接觸后可立即引起蛋白質(zhì)濃度提高，短時間內(nèi)又有所下降，反復(fù)幾次后蛋白質(zhì)濃度基本穩(wěn)定在明顯高于MSL未作用于菌體時的濃度值?？梢源_定，MSL可損傷細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)，引發(fā)胞液外流，同時，胞液中的蛋白酶造成蛋白質(zhì)部分被分解，引起蛋白質(zhì)濃度發(fā)生上述變化。上述研究證明，細(xì)菌細(xì)胞膜是MSL作用的主要靶點之一。

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