吳 丹，姚棟萍，李鶯歌，吳 俊，伍富根，鄧啟云,3

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128 ； 2. 雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410125；3.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙410125）

水稻（Oryza sativa L.）是重要的糧食作物之一，中國(guó)是世界上最大的水稻生產(chǎn)國(guó)。水稻的矮化育種和雜交水稻育種，實(shí)現(xiàn)了中國(guó)水稻單產(chǎn)的兩次跨越式發(fā)展。目前,我國(guó)正在醞釀著水稻育種的第三次飛躍，即以水稻亞種間雜種優(yōu)勢(shì)利用為主的超級(jí)稻育種[1]。但是秈粳亞種間雜交后代，存在結(jié)實(shí)率低、性狀不易穩(wěn)定和瘋狂分離等問(wèn)題?；ㄋ幣囵B(yǎng)（花培）又叫單倍體培養(yǎng)，是用處于特定時(shí)期的花藥經(jīng)人工離體培養(yǎng)，使花藥中的花粉粒單性發(fā)育成單倍體植株的過(guò)程。單倍體植株經(jīng)過(guò)自然或人工處理，染色體加倍形成純二倍體，后代性狀穩(wěn)定。與常規(guī)育種方法相比，花藥培養(yǎng)技術(shù)有著可縮短育種年限、后代遺傳變異類型豐富、選擇效率高等優(yōu)點(diǎn)[2]。近年來(lái)，花藥培養(yǎng)技術(shù)在水稻育種中被廣泛研究。筆者從影響水稻花藥培養(yǎng)的因素、存在的問(wèn)題以及下一步的研究方向等方面進(jìn)行探討，以期為花藥培養(yǎng)實(shí)踐提供理論參考。

1 水稻花藥培養(yǎng)研究的回顧

日本學(xué)者新關(guān)宏夫于1968年用花藥離體培養(yǎng)首次得到了花培植株，開(kāi)啟了花藥培養(yǎng)研究的先河[3]。我國(guó)水稻花藥培養(yǎng)的研究開(kāi)始于1970年，1975年首次利用花培技術(shù)育成了粳稻新品種單豐1 號(hào)。之后研究者們紛紛開(kāi)展提高水稻花培效率的相關(guān)研究，并將花藥培養(yǎng)技術(shù)與育種相結(jié)合[4]，在選育新品種，創(chuàng)新原始材料，不育系、恢復(fù)系的選育與提純方面，都取得了一定的成效。通過(guò)花藥培養(yǎng)相繼育成了一系列性狀優(yōu)良的品種，如中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的中花系列品種、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的龍粳系列品種、天津市農(nóng)作物研究所選育的花育系列品種等[5]。目前，通過(guò)花培選育的常規(guī)水稻品種已有近40個(gè)。

亞洲栽培稻包括秈稻和粳稻兩大亞型。粳稻相對(duì)來(lái)講較易誘導(dǎo)，其花藥培養(yǎng)在育種中已取得良好的效果[6]。而秈型水稻，由于出愈率較低，有些材料甚至難以誘導(dǎo)出愈傷組織[7]，其花粉培養(yǎng)的株產(chǎn)率平均只有1%～3%[8]，所以花藥培養(yǎng)技術(shù)在秈稻育種中的應(yīng)用還十分有限。目前，通過(guò)花培選育的秈稻品種還比較少，至20 世紀(jì)末僅有5個(gè)，且推廣面積都不大。突破秈稻花藥培養(yǎng)技術(shù)難點(diǎn)，加快秈稻花培在育種中的應(yīng)用是當(dāng)前水稻花培亟待解決的難題。

2 影響水稻花藥培養(yǎng)力的因素

2.1 基因型

供體品種的基因型是影響水稻花藥培養(yǎng)最關(guān)鍵的因素，不同基因型的水稻品種，其花藥培養(yǎng)力存在明顯差異。沈錦驊等[9]對(duì)比分析了各種類型的水稻材料之后，得出各類型水稻的花藥培養(yǎng)力由強(qiáng)到弱依次為糯稻＞粳稻＞秈粳型雜交稻＞秈稻，但不同材料之間差異較大。陳兆貴等[10]的研究表明，花藥培養(yǎng)力是受親本控制的遺傳性狀，如果父本和母本的培養(yǎng)力均較強(qiáng)，F(xiàn)1 代的培養(yǎng)力也會(huì)較強(qiáng)。并且有研究顯示，愈傷組織的誘導(dǎo)和綠苗的分化之間相關(guān)性顯著，且均是由多基因控制的數(shù)量性狀[11]。其中，影響花藥培養(yǎng)力的基因被認(rèn)為在1 號(hào)染色體上，而控制綠苗與白苗分化比例的基因位于10 號(hào)染色體上[12]。何平等[13]對(duì)110個(gè)DH 系進(jìn)行花藥培養(yǎng)力的數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs）分析，得到了與愈傷組織誘導(dǎo)有關(guān)的5個(gè)QTLs，分別分布在第6、7、8、10 和12 號(hào)染色體上，與綠苗分化率有關(guān)的2個(gè)QTLs 分布在1 號(hào)和9 號(hào)染色體上。研究認(rèn)為，如果將能提高愈傷誘導(dǎo)率和綠苗分化率的QTLs聚合在一起，篩選出愈傷誘導(dǎo)率和綠苗分化率均較高的材料，將大幅度提升花藥的培養(yǎng)力。

2.2 取材與預(yù)處理

單核靠邊期是水稻花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期?；ㄋ庍^(guò)老或過(guò)嫩，都會(huì)影響愈傷的誘導(dǎo)率。田間取樣的最佳時(shí)間一般為晴天的上午8︰00～10︰00 或下午16︰00～18︰00，此時(shí)細(xì)胞處于旺盛的分裂期。在試驗(yàn)過(guò)程中，可通過(guò)某些器官的形態(tài)特征來(lái)判斷花藥的發(fā)育時(shí)期。通常，花藥的單核靠邊期，穗子苞大而不破，穎殼淺綠色，花藥淡黃色，花藥長(zhǎng)度伸長(zhǎng)至穎殼2/5～1/2處，劍葉與下一葉的葉枕距為5～10 cm[14]。但這種形態(tài)判斷指標(biāo)比較粗放，不同的材料間存在較大差異，故不同的材料取材時(shí)要綜合衡量。

低溫預(yù)處理是提高花培效率最常規(guī)有效的手段，可使水稻愈傷組織誘導(dǎo)率提高幾倍至幾十倍。低溫處理的作用機(jī)制是延緩花粉的退化、維持花粉發(fā)育的生理環(huán)境、提高內(nèi)源生長(zhǎng)素水平、降低乙烯含量、啟動(dòng)雄核發(fā)育等。張躍非等[15]認(rèn)為低溫預(yù)處理的最適溫度為8℃，時(shí)間以8 d 為宜。目前4℃處理7 d，或7～8℃處理8～10 d，都可獲得較好的效果。但最佳處理溫度和時(shí)間因材料而異，一般來(lái)說(shuō)較低的處理溫度需要較短的放置時(shí)間，較高的處理溫度需要較長(zhǎng)的放置時(shí)間。

2.3 培養(yǎng)基

2.3.1 培養(yǎng)基的種類與成分 培養(yǎng)基的類型也是影響水稻花培效率的重要因素之一。不同的試驗(yàn)材料，適用的培養(yǎng)基不一樣。目前，還沒(méi)有一種萬(wàn)能的培養(yǎng)基能適用于各種不同類型水稻材料的花藥培養(yǎng)。培養(yǎng)基中氨態(tài)氮與硝態(tài)氮的比例及氨離子的用量對(duì)花培的影響較大，秈稻氨離子以3.5 mmol/L 效果較佳，粳稻的則為7 mmol/L，秈粳交雜種的介于兩者之間。鎂離子的用量，對(duì)花培效率也有一定影響。朱至清等[16]的研究表明，鎂離子以2.2 mg/L 較好，不僅有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，還有利于綠苗的分化。適宜的鐵離子濃度，也能夠提高花藥培養(yǎng)力。過(guò)壘生等[17]的研究表明，鐵離子的用量與2,4-D 的濃度有關(guān)。研究者為了得到最佳的培養(yǎng)效果，通過(guò)改變培養(yǎng)基中各組分的用量，設(shè)計(jì)了多種培養(yǎng)基。其中，N6 培養(yǎng)基適用于粳稻的花培，合5 培養(yǎng)基適用于秈稻[18]，改良的M 8、SK3培養(yǎng)基則對(duì)秈粳雜種有較好誘導(dǎo)效果[19]。馮雙華等[20]的研究表明，改良的M 8 培養(yǎng)基對(duì)基因型不同的材料有較廣泛的適應(yīng)性。培養(yǎng)基的各種組分相互作用相互影響，如果要通過(guò)逐個(gè)試驗(yàn)去找到每個(gè)元素的最佳用量，不僅工作量大，而且成效不一定顯著，因此在篩選培養(yǎng)基種類時(shí)抓住主次顯得尤為重要。

2.3.2 激素配比 花藥離體培養(yǎng)過(guò)程中，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的用量和配比對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和綠苗的分化都至關(guān)重要。有研究表明，在只含2,4-D 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷組織比較松軟，呈黏液化，較難分化。而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加NAA 和KT，可以改善愈傷組織質(zhì)量，提高愈傷組織的誘導(dǎo)率[21]。復(fù)合激素能顯著提高水稻花藥培養(yǎng)力，不同材料的最適激素種類及配比差異較大。馮雙華等在秈型水稻材料中，添加1.5 mg/L的2,4-D 和NAA 取得了較好的誘導(dǎo)效果。在培養(yǎng)基中添加KT 可以提高愈傷的誘導(dǎo)率，但是提高誘導(dǎo)率的同時(shí)也增加了白苗率?？傮w來(lái)說(shuō)，秈稻所需要的激素含量更高，激素種類和配比因材料而異。

2.3.3 碳源與其他添加劑 碳源不僅提供能量，而且是培養(yǎng)基滲透環(huán)境的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)。糖類是主要的碳源，蔗糖被認(rèn)為是植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源，一般認(rèn)為3%～6%的蔗糖為水稻花藥培養(yǎng)的常規(guī)用量。孫宗修等研究發(fā)現(xiàn)在麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上，愈傷組織平均誘導(dǎo)率顯著高于以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基。麥芽糖并不是適用于所有基因型的水稻材料，有些材料在麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)量較差。另外，也有用砂糖做碳源取得較好誘導(dǎo)效果的研究報(bào)道。但可能是砂糖純度低，除了提供能量和滲透壓外，還補(bǔ)充了一些微量元素，從而提高了花藥的培養(yǎng)力。其他一些添加劑對(duì)于提高花藥培養(yǎng)力也有一定效果。在培養(yǎng)基中添加脯氨酸、水解酪蛋白、山梨醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以緩解愈傷長(zhǎng)勢(shì)不好的狀況[22]。添加山梨醇可明顯改善愈傷組織生長(zhǎng)狀況，提高其再分化能力；活性炭是最常用的添加劑，有研究表明，活性炭可以提高煙草花培的出苗率[23]。丁元豐等[24]認(rèn)為活性炭對(duì)苗高、根長(zhǎng)、根數(shù)和鮮重均有顯著促增作用。還有報(bào)道稱，鍺能夠降低白苗率，多效唑能明顯提高綠苗分化率和壯苗等[25]。馮英等[26]研究發(fā)現(xiàn)，添加1 mg/L 的烯效唑（S-3307）能促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)率和綠苗分化率。

3 水稻花培亟需解決的問(wèn)題及對(duì)策

3.1 基因型的影響

基因型是影響水稻花藥培養(yǎng)力最關(guān)鍵的因素。秈稻花藥培養(yǎng)力很低，阻礙了其在育種上的應(yīng)用。要提高秈稻的花藥培養(yǎng)力，最根本的辦法是通過(guò)雜交等遺傳改良手段，把高培養(yǎng)力基因?qū)氲絻?yōu)良親本或雜種中，通過(guò)改變基因型，來(lái)提高材料的花藥離體培養(yǎng)能力。但要通過(guò)這種辦法同時(shí)得到農(nóng)藝性狀良好，花藥培養(yǎng)力高的材料還存在一定困難。目前，常用的方法是從已有的優(yōu)良性狀材料中，篩選出花藥培養(yǎng)力高的材料進(jìn)行花培。一般而言，粳稻花藥培養(yǎng)力大于秈稻，在育種中常以粳稻作為橋梁親本，來(lái)提高秈稻花藥培養(yǎng)力。但橋梁親本重復(fù)使用，會(huì)使遺傳血緣日益狹窄。如果以廣親和品種為橋梁親本，可在一定程度上減輕這一狀況。為了解決水稻遺傳背景貧乏的問(wèn)題，可收集大量的野生稻做原始材料，進(jìn)行廣親和性雜交研究，使花藥培養(yǎng)在材料上取得突破，以發(fā)揮花培育種的優(yōu)勢(shì)。

3.2 褐化

花藥的褐化是指花藥在培養(yǎng)過(guò)程中釋放褐色物質(zhì)，花藥逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象。花藥里面的小孢子發(fā)育需要花藥提供營(yíng)養(yǎng)，誘導(dǎo)早期，花藥褐化，小孢子將會(huì)由于得不到充足的營(yíng)養(yǎng)而退化，從而影響愈傷組織的誘導(dǎo)形成。褐變發(fā)生的條件很復(fù)雜，不只是多酚和多酚氧化酶直接作用的結(jié)果[27]。引起花藥褐化的因素很多，首先取材時(shí)期特別關(guān)鍵，單核靠邊期是花粉培養(yǎng)的最佳時(shí)期，過(guò)老的花藥在培養(yǎng)過(guò)程中更容易引起褐化。另外，光照過(guò)強(qiáng)和較高的培養(yǎng)溫度均會(huì)提高氧化酶的活性，從而促進(jìn)酚類物質(zhì)氧化而引起褐化。還有研究表明，降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度和微量元素錳的含量也可以降低褐化率。

3.3 白化

白化是指離體培養(yǎng)得到的幼苗整株或部分失綠，表現(xiàn)為白色或者黃色，白化植株的產(chǎn)生是禾本科植物花藥培養(yǎng)的特征之一。有研究認(rèn)為，這可能是禾本科植物DNA 共同的特殊性，他們對(duì)離體條件十分敏感，易發(fā)生缺失或其他變異[28]?？臻g誘變能改善一些誘變材料的白苗分化率，但綜合性狀表現(xiàn)仍然較差[29]。陳啟偉等[30]認(rèn)為液體培養(yǎng)基可以提高綠苗率。另外，降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度和微量元素錳的含量，在不影響正常生長(zhǎng)和分化的前提下降低溫度，減少光照均可以降低白苗率[31]。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，添加過(guò)量的2,4-D或者KT，可提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，但同時(shí)也提高了白苗率。因此，在培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織要給予充足的營(yíng)養(yǎng)，減少不當(dāng)?shù)拇碳ぁＤ壳?，白苗現(xiàn)象仍然是一個(gè)難以解決的問(wèn)題。

4 結(jié)語(yǔ)

雜交水稻育種從雜種優(yōu)勢(shì)利用水平上，分為品種間、亞種間和遠(yuǎn)緣間雜種優(yōu)勢(shì)利用3個(gè)階段。品種間由于親緣關(guān)系較近使得雜種優(yōu)勢(shì)弱；亞種間尤其是秈粳間雜種優(yōu)勢(shì)更明顯，產(chǎn)量潛力大，但采用傳統(tǒng)方法來(lái)穩(wěn)定秈粳亞種間雜交后代性狀的時(shí)耗長(zhǎng)、難度大，而花藥培養(yǎng)可加快后代性狀的穩(wěn)定速度，縮短育種時(shí)間。目前，大部分水稻的花藥培養(yǎng)力仍然較低，尤其是秈稻，很難滿足育種需求。攻克秈稻出愈率低、愈傷組織易褐化、白化等瓶頸，全面提升水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代育種的迫切要求?；蛐褪怯绊懟ㄋ幣囵B(yǎng)力的關(guān)鍵因素，但培養(yǎng)條件同樣重要?；蛐头矫?，可從性狀優(yōu)良的水稻材料中選擇花藥培養(yǎng)力高的材料進(jìn)行培養(yǎng)，或通過(guò)導(dǎo)入高培養(yǎng)力基因來(lái)提高材料的花藥培養(yǎng)力。培養(yǎng)條件方面，取材時(shí)期、預(yù)處理、培養(yǎng)基、激素、添加劑，培養(yǎng)環(huán)境等均會(huì)影響花藥培養(yǎng)力，不同材料的適宜培養(yǎng)條件各異，所以要在前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上不斷探索，因材料而異地尋找某種或者某類材料的最佳培養(yǎng)條件。在今后研究中，要進(jìn)一步研究花藥離體培養(yǎng)體系和遺傳機(jī)理等課題，完善花培育種模式，使花藥培養(yǎng)技術(shù)尤其是秈稻花培技術(shù)更加成熟，更好地為水稻育種服務(wù)。同時(shí)，也要將花藥培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因、分子標(biāo)記等分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，加快育種進(jìn)程，提高育種效率。

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