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        馬兜鈴酸檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

        2015-10-09 05:25:26瞿俊勇張明軍
        湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年2期
        關(guān)鍵詞:酸類馬兜鈴法測(cè)定

        田 夢(mèng),瞿俊勇,馬 慧,張明軍

        (1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙410128;2. 湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙410127)

        馬兜鈴酸(Aristolochic Acid,AA)是自然界中發(fā)現(xiàn)的第一種含硝基化合物,由3,4-次甲二氧基-10-硝基-1-菲酸衍生而來。馬兜鈴屬植物種類繁多、品種豐富。目前,已知品種超過了450種,而我國(guó)范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)有56種以上,且在各地均有分布,以西南及南部地區(qū)最多[1]。長(zhǎng)期以來,含馬兜鈴酸的中草藥被廣泛應(yīng)用于各種疾病的防治領(lǐng)域,但隨著臨床應(yīng)用增多以及試驗(yàn)研究的不斷深入,馬兜鈴酸的各種副作用和毒性被相繼報(bào)道出來[2]。于是,建立穩(wěn)定、可重復(fù)的馬兜鈴酸類物質(zhì)檢測(cè)體系十分必要。目前,馬兜鈴酸的分析檢測(cè)方法主要有薄層層析法、薄層掃描法、極譜法、HPLC法、熒光分析法、氣相色譜分析法、TLC-UV 分光光度法和二階導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)定法等[3]。

        1 馬兜鈴酸的分子結(jié)構(gòu)

        馬兜鈴酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是C-1 有羧基,C-3、C-4 有次甲二氧基,見圖1。目前,已發(fā)現(xiàn)天然存在的馬兜鈴酸有A、B、C、D、E,7-甲氧基馬兜鈴酸,7-羥基馬兜鈴酸等,見圖2。對(duì)馬兜鈴酸類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析主要通過光譜解析,特別是氫核磁共振波譜法(1H-NMR)。由于該類型化合物的質(zhì)譜有較強(qiáng)的分子離子峰,因此很容易通過質(zhì)譜方法推定其分子式,再根據(jù)其基本母核通過1H-NMR 芳香質(zhì)子的解析,結(jié)合必要的去偶實(shí)驗(yàn),就可推定各個(gè)芳香質(zhì)子的位置,從而確定其結(jié)構(gòu)。

        圖1 馬兜鈴酸的分子結(jié)構(gòu)式

        2 馬兜鈴酸的檢測(cè)方法

        2.1 高效液相色譜法

        圖2 不同類型天然馬兜鈴酸分子的特殊基團(tuán)

        近年來,高效液相色譜法作為一種穩(wěn)定、可靠、高效的分析方法,在中藥材成分研究領(lǐng)域被廣泛使用,特別是對(duì)于成分差別細(xì)微的單味中草藥以及成分極為復(fù)雜的中藥復(fù)方制劑的鑒別領(lǐng)域。該方法的分離鑒別能力大大優(yōu)于其他鑒定方法,且具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

        2.1.1 藥材及中藥組合中馬兜鈴酸類成分測(cè)定 葛孝忠等[4]建立了HPLC 法測(cè)定辛芩顆粒中馬兜鈴酸A的限度,檢測(cè)出馬兜鈴酸A 在細(xì)辛藥材和細(xì)辛顆粒中的回收率為98.1%和98.34%。吳艷蓉等[5]采用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地遼細(xì)辛種子以及果實(shí)中不同部位中的馬兜鈴酸A 含量進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示遼細(xì)辛果實(shí)各部位中均含有馬兜鈴酸A,其中以種子中的含量最高,而不同產(chǎn)地遼細(xì)辛種子中馬兜鈴酸A 的含量有較大差異。韓娜等[6]采用RP-HPLC 法對(duì)14種中藥材中的馬兜鈴酸A 進(jìn)行含量測(cè)定,結(jié)果顯示廣西山慈菇、短尾細(xì)辛、萬源山慈菇、苕葉細(xì)辛、關(guān)木通、尋骨風(fēng)、川細(xì)辛、宜賓防己、淮通、廣元防己這10種中藥材中馬兜鈴酸A 的含量分別為0.13、0.15、0.18、0.22、0.49、0.52、0.58、0.72、0.94、3.00 mg/g,而平昌防己、冕寧防己、穆平馬兜鈴、北細(xì)辛這4種中藥材的地上及地下部分中均未檢出馬兜鈴酸A。王亮等[7]采用RP-HPLC法測(cè)定了不同劑量竹葉配伍關(guān)木通中馬兜鈴酸A 的溶出量,結(jié)果表明關(guān)木通中馬兜鈴酸A 的溶出量為0.106 mg/m L;竹葉與關(guān)木通以1∶4 的比例配伍,馬兜鈴酸A 的溶出量為0.041 mg/m L。

        2.1.2 中成藥中馬兜鈴酸類成分測(cè)定 全世建等[8]采用RP-HPLC 法對(duì)關(guān)木通和龍膽瀉肝湯中各拆方組進(jìn)行馬兜鈴酸A 測(cè)定,以觀察其變化趨勢(shì),從而探討不同中藥配伍對(duì)馬兜鈴酸A 含量的影響。結(jié)果表明,與關(guān)木通相比,龍膽瀉肝湯的全方組中馬兜鈴酸A 的含量最低。倪琳等[9]用HPLC 法對(duì)五味渣馴丸中主要成分馬兜鈴酸A 進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示,馬兜鈴酸A的線性范圍為0.024~0.247 μg(r=0.999 99),平均回收率為96.83%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.74%。葉志斌等[10]用HPLC 法測(cè)定了純陽(yáng)正氣丸清寧丸、川芎茶調(diào)丸、龍膽瀉肝丸和關(guān)木通藥劑這4種中成藥中馬兜鈴酸A 的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在同等條件下進(jìn)行提取,關(guān)木通水煎劑中馬兜鈴酸A 的含量?jī)H相當(dāng)于甲醇提取液中的1/3;而川芎茶調(diào)丸、青寧丸和龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸A 含量很低,關(guān)木通粗粉中馬兜鈴酸A 含量平均為0.23%。唐秀玲等[11]通過萃取、過固相萃取小柱對(duì)消腫止痛酊中馬兜鈴酸A 進(jìn)行提取純化,應(yīng)用HPLC 法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,該方法可有效提取消腫止痛酊中的馬兜鈴酸A,同時(shí)該方法簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可作為控制消腫止痛酊安全性的檢測(cè)方法。陳娜娜等[12]采用超聲、固相萃取法對(duì)辛芩膠囊中馬兜鈴酸A 進(jìn)行提取純化,在利用HPLC 法測(cè)定其含量,結(jié)果顯示,該方法簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于辛芩膠囊中馬兜鈴酸A 的限量檢查。劉雅琳等[13]建立了馬兜鈴酸A 微量檢測(cè)體系,對(duì)目前使用的含馬兜鈴酸A 的中草藥材以及易與含馬兜鈴酸藥材混淆的中草藥材和中成藥進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明該方法重復(fù)性好、靈敏度高,可用于含微量馬兜鈴酸A 中草藥材或中成藥限量檢測(cè)。阮葉萍等[14]采用RP-HPLC法,測(cè)定當(dāng)歸四逆湯中各組分的馬兜鈴酸A 含量,發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯全方中的馬兜鈴酸A 含量最低,關(guān)木通+補(bǔ)血組中的馬兜鈴酸A 含量也較低。

        2.2 其他檢測(cè)方法

        超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法(HPLCMS/MS)是一種分析速度快、定性準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,已在中藥質(zhì)量控制、中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究、中藥化學(xué)成分分析以及中藥代謝研究中廣泛使用。劉螢等[15]利用超高效液相色譜-電噴霧三重四極桿質(zhì)譜儀建立了中藥中馬兜鈴酸A 和B 的定性定量分析方法,結(jié)果表明該方法靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便,適用于中藥材/飲片及中成藥中馬兜鈴酸A 和B 的痕量檢測(cè)。周圍等[16]建立了中成藥中馬兜鈴酸A 的超高液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法,測(cè)定結(jié)果表明,馬兜鈴酸A 在超高壓液相色譜-質(zhì)譜的選擇離子記錄(SIR)中有較強(qiáng)的分子離子峰,檢出限為0.1 mg/kg,可以滿足中成藥中對(duì)馬兜鈴酸A 的測(cè)定要求。季文萱等[17]通過酶活化法和化學(xué)活化法使馬兜鈴酸A 與脫氧腺苷酸反應(yīng)合成馬兜鈴酸A-DNA 加合物,優(yōu)化各種反應(yīng)條件后,利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對(duì)合成的馬兜鈴酸A-DNA 加合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸A活化后能與腺嘌呤形成馬兜鈴酸A-DNA 加合物,LC-MS/MS 技術(shù)能夠快速方便準(zhǔn)確地檢測(cè)馬兜鈴酸A-DNA 加合物。

        紫外可見分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)波長(zhǎng)為200~760 nm 這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。該方法主要依據(jù)物質(zhì)分子對(duì)不同波長(zhǎng)和特定波長(zhǎng)處的輻射吸收程度來測(cè)量物質(zhì)濃度。由于不同濃度的吸收光譜不同,可獲得不同吸收光譜的曲線,同時(shí)吸收峰數(shù)值與濃度成正比關(guān)系,從而通過峰數(shù)值來確定物質(zhì)的濃度。該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好,應(yīng)用范圍較廣。劉學(xué)湘等[18]采用反向HPLC 二元梯度洗脫法提取13種青木香發(fā)酵品中的馬兜鈴酸A,并采用紫外分光光度法測(cè)定這些發(fā)酵品中的總馬兜鈴酸含量,結(jié)果表明各種真菌發(fā)酵可在不同程度上降低中藥青木香中腎毒性成分馬兜鈴酸A 和總馬兜鈴酸的含量。張萍[19]采用紫外分光光度法測(cè)定馬蹄香不同部位馬兜鈴酸A的含量,結(jié)果表明馬兜鈴酸A 主要存在于馬蹄香的地下根部位;通過不同年份馬蹄香植物中馬兜鈴酸A 的含量比較分析,得出馬兜鈴酸A 在馬蹄香植物內(nèi)存在比較穩(wěn)定。

        3 結(jié)語(yǔ)

        越來越多關(guān)于馬兜鈴酸類物質(zhì)對(duì)人體危害性的報(bào)道,引起人們對(duì)馬兜鈴酸類物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的重視。對(duì)于已知含有馬兜鈴酸類物質(zhì)的藥物,人們可以采取措施,棄用該藥或采用替代藥物,而對(duì)于未知的或是懷疑可能含有馬兜鈴酸類物質(zhì)的非馬兜鈴科屬的中草藥,就可能存在疏忽遺漏。因此,建立一種可靠的方法來檢測(cè)疑似含有馬兜鈴酸類物質(zhì)的中成藥和藥用植物,對(duì)于指導(dǎo)臨床采取防范措施以及更合理用藥具有重大意義??偨Y(jié)前人的研究成果,筆者認(rèn)為HPLC法是檢測(cè)馬兜鈴酸A 的有效方法,與其他方法相比,具有以下優(yōu)點(diǎn):靈敏度高、分辨率高、樣品用量少、容易回收;樣品經(jīng)過色譜柱后不會(huì)被破壞,可以收集單一組分;速度快,通常一個(gè)樣品在15~30 min 內(nèi)即可完成檢測(cè)。

        [1]王 瑛,潘競(jìng)先.馬兜鈴屬植物化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2000,12(6):84-93.

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        [19]張 萍.紫外分光光度法測(cè)定馬蹄香植物不同器官中馬兜鈴酸A的含量[J].價(jià)值工程,2012,31(1):293-294.

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