付喜愛，張德顯，周 維，于立輝，田春蓮，劉明春

（沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866）

同源重組是指發(fā)生在姐妹染色體之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合，常用于基因敲除或者置換。目前，同源重組中以λRed同源重組系統(tǒng)在細菌中應用最廣。Red同源重組系統(tǒng)是由λ噬菌體的exo、beta、gam 3個基因分別編碼的Exo、Beta（β）和 Gam（γ）蛋白組成。γ蛋白抑制內(nèi)源性RecBCD和SbcCD核酸酶作用［1］，從而保護導入的DNA鏈免于降解；Exo蛋白能從5′端到3′端降解雙鏈DNA（dsDNA）中一條鏈，留下全長的一條單鏈 DNA（ssDNA）［2－3］；β蛋白與ssDNA結合并催化其退火，在復制叉出與新合成的鏈結合作為岡崎片段的一部分［2－3］，形成重組體。dsDNAλRed重組過程與寡核苷酸重組過程一樣［4］。Ellis H M 等［5］研究表明，λ噬菌體上的exo缺失對ssDNA重組的效率沒有影響，gam缺失重組率大約降低為原來的1／5，說明ssDNAλRed重組中只有beta是必不可少的。Mosberg J A等［2］研究支持全長的ssDNA作為重組中間體，有助于闡明內(nèi)源性核酸酶如何作用于重組的ssDNA和dsDNA，為λRed重組機制提供了新的見解，對正確應用重組技術就有指導意義。

λRed重組系統(tǒng)是大腸埃希菌靶基因置換的有效技術，為染色體DNA、質(zhì)?；駼AC上靶基因整合、刪除和點突變提供了簡單而有效的方法［2］。利用λRed重組技術不僅可以構建工程菌，還可以為研究細菌的致病機理和耐藥機制提供新的方法。據(jù)報道有許多因素可影響重組頻率，如底物濃度、同源片段的長度、內(nèi)源性核酸酶、錯配蛋白等［6－9］。論文綜述了λRed重組技術的研究進展及影響重組的因素，以期為優(yōu)化重組試驗方案及提高重組效率提供幫助。

1 λRed同源重組技術的應用

λRed同源重組技術的原理是將一段攜帶與靶基因兩翼各有40bp～60bp同源序列的PCR產(chǎn)物或合成的寡核苷酸片段，通過電轉(zhuǎn)化導入宿主菌細胞內(nèi)，在λ噬菌體編碼的Red重組酶的作用下，使導入細胞內(nèi)的線性DNA片段與染色體或載體的特定靶序列進行高效的同源重組，將靶基因置換下來。λRed同源重組系統(tǒng)是細菌基因敲除的有力技術，基因的缺失或置換是確定基因的未知功能、闡明致病機理的重要手段。利用λRed同源重組系統(tǒng)進行基因敲除在細菌中尤其是大腸埃希菌中的應用最為廣泛。

1.1 構建工程菌，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量

λRed同源重組系統(tǒng)在細菌中非常重要的應用就是構建工程菌。其主要目的是通過敲除細菌中的某個基因，改變細菌的代謝途徑，提高人類所需代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。趙志軍等［10］利用λRed同源重組技術在敲除大腸埃希菌的mtr基因的基礎上，構建mtr.tnaB和mtr.aroP雙基因敲除菌，從而提高色氨酸的產(chǎn)量。陳欣等［11］利用λRed同源重組系統(tǒng)敲除一株可高效合成氨基葡萄糖GlcN和其乙?；苌颪－乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的重組大腸埃希菌Escherichiacoli－glms－gna1的nagE和 manX，獲得單基因敲除工程菌E.coli－glms－gna1－ΔnagE和nagE／manX雙基因敲除的工程菌E.coli－glmsgna1－ΔnagE－ΔmanX，這兩株工程菌GlcN的最大產(chǎn)量分別是對照菌株的1.08倍和1.20倍，GlcNAc的最大產(chǎn)量分別是對照菌的1.7倍和2.86倍，對GlcN的工業(yè)化生產(chǎn)具有指導意義。郭媛等［12］利用λRed同源重組技術敲除大腸埃希菌BW25113的pflB、frdAB、fnr、AdhE基因，成功構建四基因敲除菌株，使得異丁醇的產(chǎn)量增加了40%。

眾所周知，L－色氨酸作為人和動物的必需氨基酸，已廣泛應用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)；氨基葡萄糖廣泛應用于保健食品和醫(yī)藥領域，氨基葡萄糖及其相關產(chǎn)品在國內(nèi)市場有巨大的開發(fā)空間和潛力；與乙醇相比，異丁醇具有物理性質(zhì)穩(wěn)定、運輸方便、生產(chǎn)耗能較少的優(yōu)點，將來極有可能代替乙醇作為車用燃料。因此可以看出，利用λRed同源重組技術構建工程菌，將會給人類和社會帶來巨大的經(jīng)濟價值。

1.2 探究細菌的致病機理

細菌致病的機理往往是多個因素相互作用的結果，很難確定某一因素對細菌致病性的影響程度。利用λRed同源重組技術敲除細菌中的某個基因，比較基因敲除前后菌株致病性的變化，從而有助于闡明致病機理。王海光等［13］利用λRed同源重組技術敲除大腸埃希菌O157∶H7的ompA基因，細胞試驗表明外膜蛋白A基因敲除菌株的黏附力下降，對闡明大腸埃希菌O157∶H7的致病機制具有重要的意義。HPI毒力島是大腸埃希菌的重要毒力因子，其中irp2基因為鐵調(diào)節(jié)蛋白［14］，與細菌的致病性有密切的關系［15］。李葉芳等［16］利用λRed同源重組技術成功敲除禽致病性大腸埃希菌HPI毒力島irp2基因，為深入探究該基因在禽致病性大腸埃希菌治病過程中所發(fā)揮的作用打下基礎。余華等［17］利用λRed同源重組技術成功敲除銅綠假單胞菌的彈性蛋白酶基因Pa，將為系統(tǒng)深入的研究彈性蛋白酶在該菌致病性中的詳細作用機理提供材料和基礎。李保利［18］應用λRed重組系統(tǒng)分別構建腸炎沙門菌C50041crp、spiC單基因缺失菌株和雙基因缺失菌株，細胞侵襲實驗表明，這3株缺失菌與野生菌株相比對細胞的侵襲力明顯降低。由此可見λRed同源重組系統(tǒng)是探究細菌致病機理的一種重要方法，為致病機制的闡明做出突出的貢獻，同時也為弱毒疫苗的生產(chǎn)奠定基礎。

1.3 研究細菌的耐藥機制

隨著抗菌藥物的不合理使用，耐藥菌株的產(chǎn)生日益增加。對耐藥菌株的耐藥機制的研究已成為熱點。λRed同源重組技術為耐藥機制的研究提供了新的思路。Wu X等［19］利用λRed同源重組技術敲除大腸埃希菌的ompW基因，藥敏試驗結果顯示基因敲除菌株對硫酸新霉素和氨芐青霉素的敏感性大大提高，從而說明ompW基因在細菌抗性方面起著關鍵的作用。孟春萍［20］采用λRed同源重組技術成功構建鴨大腸埃希菌標準菌株主動外排基因acrB基因缺失菌株，敲除acrB基因后菌株對慶大霉素、頭孢噻呋、氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素等5種藥物的敏感性較原菌株明顯升高，表明acrB基因在主動外排中有重要作用。陳彩杰［21］應用λRed同源重組技術成功構建鴨大腸埃希菌標準菌株主動外排調(diào)控基因marA基因缺失菌株，藥敏試驗結果顯示慶大霉素、頭孢噻呋、恩諾沙星、多西環(huán)素對marA基因缺失菌株的MIC值較原菌株的顯著下降；并且通過熒光定量PCR方法檢測到marA基因缺失菌株的各主動外排基因的mRNA的相對表達量均有所下降，表明marA基因?qū)喆竽c埃希菌多重耐藥具有一定的調(diào)節(jié)作用。由此可見，通過λ Red同源重組技術可以明確某基因在耐藥方面所起到的作用，有助于闡明耐藥機制，為新藥的合成提供理論平臺。

1.4 其他方面

何彰華等［22］利用λRed同源重組技術成功構建了一種四環(huán)素抗性表達載體pET－mt28a（＋），并可介導多基因的協(xié)同表達。牛小羽等［23］使用λRed同源重組技術構建弗氏志賀菌2aphoN1基因缺失菌株，初步探究phoN1基因在該菌中的作用。Hu S B等［24］研究發(fā)現(xiàn)，λRed同源重組系統(tǒng)為研究根癌土壤桿菌基因功能組學和改良菌株提供了簡便而快速的方法?？傊?，λRed同源重組技術推動了細菌基因功能組學的研究。

2 影響λRed同源重組的因素

λRed同源重組的應用往往因重組頻率而受到限制。研究人員發(fā)現(xiàn)，許多因素可影響重組頻率，如底物濃度、同源片段的長度、內(nèi)源性核酸酶、錯配蛋白等。深入了解影響同源重組的影響因素，對提高重組頻率，拓寬λRed同源重組技術的應用具有重要意義。

2.1 底物和目的片段

細菌常以線性打靶片段dsDNA或ssDNA為底物進行λRed同源重組。線性打靶片段的構成相同，中間常為用于選擇的標記基因片段，兩側為靶基因上下游的同源片段。

2.1.1 線性 DNA 的濃度 Yu D等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在大腸埃希菌中，只需要較低濃度（300ng）的線性dsDNA，λRed重組就能達到最大重組頻率；當濃度繼續(xù)增加，甚至遠遠超出此濃度時，重組頻率不但不升高反而降低。而當ssDNA的濃度相對較高（5μg）時，重組的頻率達到最大。

2.1.2 同源片段的長度 在大腸埃希菌中，同源片段長度為40bp的線性dsDNA能足夠有效的進行λRed重組；當同源片段長度從40bp增加到1 000bp時，重組頻率只增加了10倍；而當同源片段的長度低于40bp時，重組頻率呈指數(shù)下降［6］。Mythili E等［25］研究表明，β蛋白能與36nt DNA鏈穩(wěn)定結合，不能與長度小于36nt DNA鏈結合。同源片段的長度可能影響其與互補片段的有效識別和配對。如果這個猜測成立的話，那么同源片段的長度也影響β蛋白與同源片段分離，進而影響著β蛋白釋放鏈的3′端和鏈的強配對。因此，如果同源片段太短，以至于不能與靶片段有效的配對，導致β蛋白仍然結合在鏈的3′端，就不能發(fā)生重組。

2.1.3 鏈偏差 Ellis H M 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，ssDNA λRed重組中非模板鏈的重組頻率大約是其相應模板鏈的5倍，這樣的鏈偏差在dsDNAλRed重組中不存在。通過檢測發(fā)現(xiàn)鏈偏差與DNA的復制方向相關。復制叉在原點向兩個方向延伸，使得寡核苷酸更容易與后隨鏈的相應區(qū)域進行重組。DNA復制方向?qū)е骆溒钫f明ssDNA重組可能發(fā)生在復制叉附近。復制過程中ssDNA出現(xiàn)瞬態(tài)區(qū)域，與β蛋白結合催化其退火。后隨鏈重組頻率的增加可能反映了在以前導鏈為模板合成后隨鏈時，單鏈區(qū)域數(shù)量增加，DNA聚合酶和DNA連接酶完全可以將退火鏈連接到染色體上。雖然鏈偏差程度和重組體絕對數(shù)量有相當大的差異，但是鏈偏差反映了染色體區(qū)域結構和重組率的變化。Costantino N等［7］研究發(fā)現(xiàn)，去除MutS蛋白的菌株中仍存在鏈偏差現(xiàn)象，說明寡核苷酸序列和錯配修復過程與鏈偏差不相關。在mutS基因敲除菌株中鏈偏差對重組頻率的影響表現(xiàn)的更加明顯［26］。

2.2 錯配蛋白

細菌中許多蛋白參與復制叉的前進。甲基導向錯配修復（methyl－directed mismatch repair，MMR）系統(tǒng)能校對復制。MMR系統(tǒng)中的MutS蛋白結合DNA鏈與系統(tǒng)中其他的功能蛋白一起修復單一堿基對錯配或者能清除1個～3個核苷酸的插入。宿主菌中的MMR系統(tǒng)能糾正復制出現(xiàn)的堿基錯配，發(fā)現(xiàn)后立即切除錯誤的堿基。ssDNA在DNA復制叉附近重組產(chǎn)生單堿基突變可能會觸發(fā)錯配修復，因而影響重組的結果。相同條件下，缺失MutS蛋白的細菌λRed重組的頻率至少提高100倍，接近1／4的活細胞中出現(xiàn)堿基突變［7］。清除MutS蛋白的研究使得遺傳修飾更加有效，并且能允許核苷酸類似物和加合物與染色體結合進行體內(nèi)生化研究。

2.3 內(nèi)源性核酸酶

盡管硫代磷酸（phosphorothioate，PT）鍵能阻礙λExo作用，但是5′端硫代磷酸化的dsDNA仍容易發(fā)生重組，這一謎團直到 Mosberg J A等［8］研究首次確定ExoVⅡ（核酸外切酶）是降解ssDNA和dsDNA末端的核酸酶時才得以解。兩端硫代磷酸化的dsDNA轉(zhuǎn)入細菌，ExoVⅡ降解一條或兩條鏈的5′端PT鍵產(chǎn)生與其結合的ssDNA末端。在ExoVⅡ作用后，λExo降解dsDNA的前導鏈，留下后隨鏈作為重組的中間體，完成這一步還需要解旋酶和其它內(nèi)源性核酸酶的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)dsDNA在不同核酸酶基因敲除菌株中的重組頻率各不相同［8］，說明內(nèi)源性核酸酶和重組基因之間密切相關，改變內(nèi)源性核酸酶的活性可能嚴重影響λRed重組，為進一步提高dsDNA重組頻率提供了有價值的策略。

Dutra B E等［9］研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌中ssDNA核酸外切酶（ExoⅠ和ExoVⅡ）能抑制重組，在多個ssDNA核酸外切酶缺失菌株中，重組頻率顯著增高。清除ExoVⅡ不僅可提高重組頻率，同時還能提高ssDNA和dsDNA 3′末端突變的遺傳。進一步研究發(fā)現(xiàn)，清除一系列的5個核酸外切酶（RecJ、ExoⅠ、ExoVⅡ、ExoⅩ和λExo）可顯著提高λRed聯(lián)合選擇多元自動化基因組工程（CoSMAGE）的操作，促進重組多樣性的產(chǎn)生和更多的同時突變的形成［8］。Gregg C J等［27］研究發(fā)現(xiàn)應用雙選標記tolC能促進CoS－MAGE的循環(huán)穩(wěn)定、持續(xù)，產(chǎn)生100%完全的基因置換，而不需要任何的間歇篩選或直接選擇。

2.4 其他因素

除了上述因素外，還存在其它的因素影響重組的效率，如λ噬菌體上pL啟動子誘導時間。pL啟動子由溫度敏感型λcⅠ阻遏因子控制，42℃時λcⅠ失活，誘導pL啟動子表達。當誘導時間為7.5min時，重組效率最大；誘導時間在7.5min～17.5min的范圍內(nèi)，能維持最大重組水平；當誘導時間長于17.5min時，重組水平降低，當pL啟動子的表達時間大于60min時，能導致細菌死亡［6］。另外，加入非特異性載體DNA能增強大腸埃希菌中λRed重組頻率［28］，這可能是因為載體妨礙內(nèi)源性核酸酶降解底物。但這種現(xiàn)象只在用于重組的寡核苷酸濃度較低時檢測到。敲除內(nèi)源性核酸酶基因的宿主菌，增加載體的數(shù)量不能使重組頻率增加。λRed重組中，非靶位點整合也影響重組頻率。Mosberg J A等［2］指出這可能是由于底物和基因組上非靶位點之間的微觀同源性導致錯誤定位，但是影響錯誤定位的因素還不確定。

3 小結

λRed同源重組系統(tǒng)是同源重組中發(fā)展最為成熟、應用最為廣泛的體內(nèi)遺傳工程研究技術，能任意的插入或刪除DNA片段而不用考慮限制性酶切位點的問題。但是在一些應用中因重組頻率而受到限制。全面深入的了解影響λRed同源重組的因素，必將為細菌基因重組試驗方案的優(yōu)化、改善重組工程的操作和深入研究重組機制提供理論依據(jù)。隨著研究的不斷深入，λRed重組技術必將應用于更廣泛的細菌乃至生物體中，從而推動功能基因組學的研究。

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