寇建平，孫亞妮，趙 欽，周恩民＊

（1.農(nóng)業(yè)部?jī)?yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)服務(wù)中心，北京100020；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)陜西科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，陜西楊凌712100）

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA 誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。小RNA（microRNA，miRNA）能夠識(shí)別特定的靶mRNA，通過降解或抑制mRNA，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)［1］。根據(jù)miRNA 前體分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而設(shè)計(jì)并合成的人工miRNA 也可以在體內(nèi)通過與內(nèi)源miRNA 相同或相似的途徑發(fā)揮RNAi作用，目前人工miRNA 技術(shù)已成功的應(yīng)用于調(diào)控基因表達(dá)以及抗病毒領(lǐng)域［2－5］。由于其在抗病毒領(lǐng)域的突出優(yōu)勢(shì)，目前以人工miRNA 介導(dǎo)的RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)的抗病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究具有廣泛的發(fā)展應(yīng)用前景［6］。然而隨著人們對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品的日益關(guān)注，其安全性也逐漸進(jìn)入人們的視野，其核心問題集中于環(huán)境安全、動(dòng)物健康與福利、人類健康與食品安全等方面。

非肌肉肌球蛋白重鏈Ⅱ－A 亞型（non－muscle myosin Ⅱ－A，NMHCⅡ－A）是與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染有關(guān)的細(xì)胞蛋白之一。體外試驗(yàn)證實(shí)，通過RNAi技術(shù)敲低NMHCⅡ－A的表達(dá)可以降低PRRSV 在易感細(xì)胞內(nèi)的增殖［7］。同時(shí)通過將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA 6.2－miRNMHCⅡ－A 注射豬體內(nèi)敲低肺臟巨噬細(xì)胞的NMHCⅡ－A 表達(dá)后，也可以部分抵抗PRRSV 的感染［8］。但是，pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 作為一種外源性DNA 進(jìn)入動(dòng)物體后的環(huán)境安全性是其從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用必須解決的一個(gè)關(guān)鍵性問題。因此，本研究著重綜述了NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)之后，對(duì)環(huán)境安全的影響，為NMHCⅡ－A 人工miRNA 轉(zhuǎn)基因豬的環(huán)境安全管理和可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 動(dòng)物逃逸對(duì)環(huán)境的影響

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一旦逃逸到環(huán)境中，它對(duì)環(huán)境的潛在危害包括生物多樣性的影響［9］、對(duì)其他動(dòng)物生存的威脅［10］、傳 播 疾 ?。?1］、打 破 生 態(tài) 平 衡［12］等 可 能性，但已有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中昆蟲逃逸的可能性是最大的，其次是魚類，轉(zhuǎn)基因家畜相對(duì)說逃逸的可能性最?。?3］。就目前的研究水平來說，即使對(duì)于轉(zhuǎn)基因昆蟲和魚類這樣一些逃逸可能性最大的動(dòng)物來說，也可通過物理、生理和生物等技術(shù)手段來綜合控制。轉(zhuǎn)基因魚類尚且如此，那么轉(zhuǎn)基因豬逃逸對(duì)環(huán)境的影響具有很高的可控性。我們對(duì)NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫和未免疫豬豬圈之間設(shè)立通道，允許被免疫豬“逃逸”到未免疫豬群中，發(fā)現(xiàn)被免疫豬并沒有影響未免疫豬正常的生存和生長(zhǎng)發(fā)育，并且豬圈的土壤、飲水和飼料中也沒有轉(zhuǎn)入基因的存在。所以退一步講，即使NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫豬發(fā)生了逃逸，對(duì)于環(huán)境來講也是安全的，更何況目前對(duì)于豬的養(yǎng)殖模式主要還是以規(guī)?；B(yǎng)殖和圈養(yǎng)為主，所以可通過物理等控制措施從源頭上遏制其逃逸。

2 NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入豬體后通過基因水平轉(zhuǎn)移方式對(duì)環(huán)境釋放安全的影響

基 因 水 平 轉(zhuǎn) 移 （horizontal gene transfer，HGT）是生物安全研究中很受關(guān)注的問題。HGT常見于微生物之間，植物和動(dòng)物雖然發(fā)生HGT 的現(xiàn)象很少，但也存在HGT 的可能性，比如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有可能會(huì)通過腸道系統(tǒng)將外源基因轉(zhuǎn)入腸道菌中；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在飼養(yǎng)過程中有可能會(huì)通過接觸、交配、分娩和泌乳等行為產(chǎn)生HGT 現(xiàn)象。

2.1 通過排泄物發(fā)生HGT 可能性分析

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的排泄物是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)環(huán)境造成影響的直接因素之一。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的外源基因有可能與動(dòng)物自身腸道微生物發(fā)生基因交換重組，從而形成新的微生物群落，隨著糞便和尿液排放到環(huán)境中，產(chǎn)生新的致病微生物危害人類健康和環(huán)境安全［14］。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)趙杰、許建香等已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬和轉(zhuǎn)基因牛的腸道和周圍環(huán)境中均不會(huì)發(fā)生外源基因的HGT 現(xiàn) 象［14－16］。利用PCR－DGGE 聯(lián) 合16 S rDNA 測(cè)序技術(shù)對(duì)NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫豬的腸道內(nèi)微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并未發(fā)現(xiàn)外源基因水平轉(zhuǎn)移到腸道菌，同時(shí)NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A免疫豬后不同時(shí)間，糞便和尿液中均不含有外源基因，轉(zhuǎn)入的NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達(dá)質(zhì)粒基因并沒有發(fā)生HGT 而漂移到腸道菌，也沒有隨著排泄物排出體外。因此，NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫豬后，轉(zhuǎn)入基因不會(huì)通過排泄物對(duì)環(huán)境安全造成威脅。

2.2 通過物理接觸發(fā)生HGT 可能性分析

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在飼養(yǎng)過程中有可能會(huì)通過接觸、交配等行為產(chǎn)生HGT 現(xiàn)象。NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A基因是否會(huì)通過豬之間的物理接觸發(fā)生HGT 也是我們所關(guān)心的問題之一。Wheeler M B等［17］已通過轉(zhuǎn)基因豬實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因豬不會(huì)通過物理接觸將外源基因轉(zhuǎn)移到生活在同一環(huán)境中的非轉(zhuǎn)基因豬中。pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 免疫豬合群至未免疫豬群中，合群后不同時(shí)間，免疫豬和未免疫豬的口鼻分泌物和精液中、未免疫豬群的糞便、尿液、血液和內(nèi)臟中均無轉(zhuǎn)入基因的存在；而且未免疫豬的生長(zhǎng)發(fā)育并未收到明顯影響。因此，轉(zhuǎn)NMHCⅡ－A 人工miRNA 豬同樣也不會(huì)通過平時(shí)的物理接觸而發(fā)生HGT 對(duì)周圍健康非免疫豬產(chǎn)生不良影響。

3 NMHCⅡ－A 人工miRNA 基因在宿主體內(nèi)的殘留時(shí)間和分布

人工miRNA 轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)之后，在動(dòng)物體內(nèi)的殘留時(shí)間和組織分布也是威脅環(huán)境和其他物種安全的一個(gè)重要因素。已有的研究表明對(duì)于以肌肉注射方式免疫的動(dòng)物，轉(zhuǎn)入基因在短時(shí)間內(nèi)會(huì)在注射部位和血液內(nèi)有殘留，但是一段時(shí)間后會(huì)逐漸消失，在其他組織器官均無分布。質(zhì)粒在體內(nèi)的停留時(shí)間與動(dòng)物種屬、代謝情況、免疫方法和次數(shù)具有相關(guān)性［18－21］。NMHCⅡ－A 人 工miRNA 重 組 表 達(dá) 質(zhì) 粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 以肌肉注射方式免疫豬24h 后，接種部位肌肉組織能檢測(cè)到質(zhì)粒的存在，而在其余組織的DNA 中均未檢測(cè)出，這提示質(zhì)粒在注射后數(shù)小時(shí)內(nèi)還沒有通過血液或淋巴循環(huán)分布到其他組織。在注射1d后，1頭豬的注射部位肌肉和血液的基因組DNA 中檢測(cè)出了質(zhì)粒DNA 基因的存在，15d后，所有組織中都檢測(cè)不到質(zhì)粒的存在，說明質(zhì)粒進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)過一段時(shí)間后大部分會(huì)被代謝降解，而自始至終在被免疫豬的其他組織臟器中均未檢測(cè)到轉(zhuǎn)入基因的存在。

4 NMHCⅡ－A 人工miRNA 與宿主細(xì)胞基因組發(fā)生整合的可能性分析

重組表達(dá)質(zhì)粒作為外源基因轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)從實(shí)驗(yàn)室走向臨床必須解決的另一個(gè)重要問題是用質(zhì)粒DNA 免疫動(dòng)物后是否會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組中［22］，對(duì)環(huán)境安全和人類健康造成威脅。重組表達(dá)質(zhì)粒存在于動(dòng)物體內(nèi)有兩種可能，一種是以游離質(zhì)粒形式存在，另一種是重組表達(dá)質(zhì)粒整合入宿主DNA 上。為消除染色體外游離質(zhì)粒DNA 的污染，我們將制備好的免疫組豬的基因組DNA 進(jìn)行純化回收，然后對(duì)各組織定量后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。哺乳動(dòng)物染色體組中的基因在不斷地發(fā)生自發(fā)突變，只要其發(fā)生的頻率對(duì)于每個(gè)基因來說不超過1×10－6，就不會(huì)對(duì)動(dòng)物的遺傳和健康造成影響［23］。本研究在免疫豬的所有組織臟器，包括注射部位肌肉組織的1μg基因組DNA 中未檢測(cè)到重組表達(dá)質(zhì)?；?，這說明1μg基因組DNA 中存在質(zhì)粒數(shù)量小于15.6個(gè)拷貝，如果所有質(zhì)粒都整合入gDNA 上而產(chǎn)生突變，按哺乳動(dòng)物基因組大小為3×109估算，1μg基因組DNA 約相當(dāng)于1.6×105個(gè)細(xì)胞，按每個(gè)細(xì)胞有3×104個(gè)基因估算，導(dǎo)致的突變率約為2×10－9，相對(duì)于自發(fā)突變率2×10－6，僅為其千分之一［24］；此外，質(zhì)粒DNA 和宿主DNA 可能是以插入和同源重組方式發(fā)生整合，但大量試驗(yàn)表明，有質(zhì)粒DNA 以插入方式的概率極小，而同源重組整合雙方必須有大于600bp高度同源的片段，所以發(fā)生外源DNA重組整合的可能性也是很低的。因此，可以認(rèn)為在未經(jīng)純化處理的注射部位肌肉組織DNA 中檢測(cè)到的pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 基因是以游離質(zhì)粒的方式存在于組織之內(nèi)，而不是與豬的基因組發(fā)生整合。所以，NMHCⅡ－A 人工miRNA 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 免疫豬，轉(zhuǎn)入基因不可能整合入豬細(xì)胞的基因組中。

研究表明，將NMHCⅡ－A 人工miRNA 轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)，可以通過利用針對(duì)NMHCⅡ－A 的miRNA 對(duì)NMHCⅡ－A 基因表達(dá)進(jìn)行沉默，從而降低PRRSV在豬體內(nèi)的增殖，提高豬抗PRRSV 感染的能力；同時(shí)NMHCⅡ－A 人工miRNA 轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)之后，對(duì)于環(huán)境釋放來講是安全的，這就為利用NMHCⅡ－A人工miRNA 轉(zhuǎn)基因豬技術(shù)培育抗PRRSV 豬新品種奠定基礎(chǔ)和提供科學(xué)支持。

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