張 武，潘 偉，馬金田，郭 濤

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

豆科植物-根瘤菌的共生固氮體系是地球物化循環(huán)中最重要的生物氮素來源，根瘤的形成是兩者信號分子交換的結(jié)果，這個過程稱之為分子對話（molecular dialogue），根瘤菌能夠產(chǎn)生結(jié)瘤因子（nod factor，NF），表面多糖和分泌蛋白等多種信號分子〔1〕。在根瘤的形成過程中，分泌蛋白在對宿主植物根毛細(xì)胞的識別，侵染，結(jié)瘤及固氮過程中發(fā)揮了重要作用〔2〕。

分泌蛋白是指在細(xì)胞內(nèi)合成，分泌到胞外起作用的蛋白質(zhì)，可以分為兩大類〔3〕，一類是經(jīng)典分泌蛋白，分泌蛋白的N-端通常含有信號肽序列，有許多軟件可以對這類蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測和分析，筆者曾對菜豆根瘤菌CFN42 含信號肽分泌蛋白進(jìn)行了研究〔4〕。另一類為非經(jīng)典分泌蛋白，這類分泌蛋白缺少常規(guī)的信號肽，不依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的膜分泌系統(tǒng)，目前對這類分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測的軟件較少，只有SecretomeP2.0 可以分析非經(jīng)典分泌蛋白。本文主要通過生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)，研究菜豆根瘤菌全基因組非經(jīng)典分泌蛋白，分析非經(jīng)典分泌蛋白與根瘤菌結(jié)瘤固氮的關(guān)系，有助于深入研究共生固氮的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料本實(shí)驗(yàn)采用菜豆根瘤菌CFN42 的全蛋白質(zhì)組5 963個蛋白質(zhì)，氨基酸序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫（ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/Rhizobium_etli_CFN_42_uid58377/）獲得。

1.2 方法首 先 用 SecretomeP2.0〔5〕（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）預(yù)測非經(jīng)典分泌蛋白，其次用 SignalP4.1〔6〕（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析上述蛋白質(zhì)是否有信號肽，將含有信號肽的經(jīng)典分泌蛋白剔除掉；非經(jīng)典分泌蛋白常規(guī)特征描述由ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析得出；COG 直系蛋白質(zhì)同源簇?cái)?shù)據(jù)庫由（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）完成，獲得功能分類；非經(jīng)典分泌蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測由 SMART〔7〕（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 非經(jīng)典分泌蛋白預(yù)測和分析利用SecretomeP2.0 和 SignalP4.1 對菜豆根瘤菌 CFN42 全基因組蛋白進(jìn)行預(yù)測，共得到596個非經(jīng)典分泌蛋白，約占蛋白質(zhì)總數(shù)的10%。在CFN42中，經(jīng)典分泌蛋白（含信號肽）共有332 個〔4〕，兩者合計(jì)占蛋白質(zhì)組的15.6%，這與分泌蛋白占細(xì)菌蛋白質(zhì)組總數(shù)的10%～20%的比例是一致的〔8〕。在596 個非經(jīng)典分泌蛋白中，位于細(xì)菌染色體上的分泌蛋白409個，而位于6個質(zhì)粒上的則有187 個，其中共生質(zhì)粒上有58 個，是所有質(zhì)粒中分泌蛋白比重最大的，這可能與共生質(zhì)粒更多的參與根瘤的形成有關(guān)。

2.2 非經(jīng)典分泌蛋白的功能預(yù)測及分析用直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫對596 個非經(jīng)典分泌蛋白進(jìn)行分析，獲得COG（cluster of orthologous group，COG）功能分類，見圖1。除了未知功能和一般功能之外，參與細(xì)胞壁或膜的合成的非經(jīng)典分泌蛋白最多，有30 個，占總數(shù)的5.03%，其次是參與翻譯，糖類代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)以及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的蛋白質(zhì)，而參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、細(xì)胞周期控制和分裂的分泌蛋白最少。

圖1 非經(jīng)典分泌蛋白的COG功能分類

在596個蛋白質(zhì)中，假定蛋白有381個，有功能描述的蛋白質(zhì)只有215個，主要集中在物質(zhì)代謝，底物轉(zhuǎn)運(yùn)，鞭毛合成和毒力侵染等方面。根瘤菌的分泌系統(tǒng)與根瘤菌的宿主專一性及共生結(jié)瘤有緊密的聯(lián)系。HlyD 家族蛋白是I 型分泌系統(tǒng)蛋白，也是一種細(xì)菌溶血素蛋白，是細(xì)菌產(chǎn)生毒力和致病性的關(guān)鍵因子〔9〕，CFN42 中含有這些分泌蛋白可能與侵染宿主植物細(xì)胞有關(guān)；III型分泌系統(tǒng)主要是鞭毛組裝蛋白，IV 型分泌系統(tǒng)主要是轉(zhuǎn)運(yùn)分泌和毒力蛋白，在其他根瘤菌中〔10〕，III 型和 IV 型分泌蛋白能夠?qū)械鞍走\(yùn)輸?shù)剿拗骷?xì)胞內(nèi)，干擾宿主的防御反應(yīng)，有利于根瘤菌的侵染。此外，一些涉及細(xì)菌溫度脅迫，氧化脅迫，藥物脅迫的蛋白質(zhì)也能夠影響根瘤菌的結(jié)瘤固氮。在研究中識別了3 個冷激蛋白，編碼這些蛋白的csp（cold shock protein）基因只在草木樨中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）中有報(bào)道，在其他根瘤菌中則未發(fā)現(xiàn)有對應(yīng)的基因，冷激蛋白可以克服低溫造成的毒害效應(yīng)〔11〕，與此同時(shí)，在經(jīng)典分泌蛋白中，CFN42 還含有耐熱凝集素蛋白〔4〕，這兩種類型分泌蛋白的存在大大增加了CFN42 對環(huán)境的適應(yīng)性，擴(kuò)大了宿主專一性的范圍；非經(jīng)典分泌蛋白中的過氧化氫酶和過氧化物還原酶能夠清除根瘤類菌體中的過氧化氫，防止固氮酶被氧化失活，可能參與了固氮過程；我們還發(fā)現(xiàn)了2個多藥外排蛋白（multidrug efflux protein），這類蛋白質(zhì)能夠幫助根瘤菌抵抗多種抗菌藥，擴(kuò)大了對宿主植物的適應(yīng)性；果膠裂解酶在根瘤菌侵染宿主植物中可以水解細(xì)胞壁，形成侵染通道，有助于根瘤菌進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。表1就是CFN42中這部分分泌蛋白的性質(zhì)描述。

為了更好的了解假定蛋白的功能，我們用SMART 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果見圖2，假定蛋白中結(jié)構(gòu)域最多的是DUF，這是一類功能未知的結(jié)構(gòu)域，其次是PbH1 和GFA，這類結(jié)構(gòu)域與酶活有關(guān)，Tad推測與鞭毛組裝有關(guān)，含有這類結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)很可能屬于III型分泌系統(tǒng)，與細(xì)菌的運(yùn)動和侵染有關(guān)。在其他數(shù)目較少的結(jié)構(gòu)域中，含有Cupin結(jié)構(gòu)域的蛋白家族與過敏性有關(guān)〔12〕，可能與根瘤菌在侵染根毛細(xì)胞的免疫反應(yīng)相關(guān)，OmPA 結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中與致病性有關(guān)，可以與宿主受體相互作用，CsbD 結(jié)構(gòu)域通常存在于細(xì)菌脅迫反應(yīng)蛋白中，與微生物的逆境生存有關(guān)，在根瘤菌中此類蛋白有助于擴(kuò)大宿主專一性和對環(huán)境的適應(yīng)性。

表1 菜豆根瘤菌CFN42部分分泌蛋白特征描述

圖2 假定蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

3 結(jié)論

在真核細(xì)胞內(nèi)，非經(jīng)典分泌蛋白通常與細(xì)胞分裂、免疫應(yīng)答、致病侵染等過程相關(guān)聯(lián)〔13〕，而在原核細(xì)胞內(nèi)的研究相對較少。本文通過生物信息學(xué)分析表明，非經(jīng)典分泌蛋白和含信號肽分泌蛋白一樣，兩者都在根瘤菌的侵染、結(jié)瘤以及固氮過程中發(fā)揮了重要作用，分泌蛋白和結(jié)瘤因子，胞外多糖一起構(gòu)成了根瘤菌宿主專一性的3種關(guān)鍵因子。非經(jīng)典分泌蛋白種類繁多，主要通過細(xì)菌分泌系統(tǒng)和其他一些未知機(jī)制分泌，本文識別了I、III、IV 型分泌系統(tǒng)，未見II 型分泌系統(tǒng)。CFN42 中存在最多的非經(jīng)典分泌蛋白主要是底物轉(zhuǎn)運(yùn)和物質(zhì)代謝，這說明根瘤菌和根瘤類菌體之間存在著廣泛的物質(zhì)和信息交流，這種機(jī)制有利于根瘤的發(fā)育和固氮功能的形成。其次，在非經(jīng)典分泌蛋白中還存在著一些多糖酶和毒力侵染蛋白，這是根瘤菌侵染宿主植物必不可少的因子，近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)根瘤菌利用相似的病原菌侵染植物的分子機(jī)制來形成共生體〔2〕，令人意外的是，各種水解酶只在經(jīng)典分泌蛋白中發(fā)現(xiàn)〔4〕，非經(jīng)典分泌蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)一個水解酶類。第三，在菜豆根瘤菌CFN42 中，還有一些數(shù)量較少的蛋白質(zhì)，冷激蛋白、多藥外排蛋白可能是根瘤菌在逆境條件下抗脅迫的分子基礎(chǔ)，以上涉及抗生素抗性，溫度敏感，藥物脅迫的分泌蛋白均與根瘤菌的宿主范圍密切相關(guān)，而且通過結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)有些分泌蛋白還可能與根瘤菌的群體感應(yīng)有關(guān)。

目前，在根瘤菌中利用生物信息學(xué)研究非經(jīng)典分泌蛋白的報(bào)道還不多〔14-15〕。豆科植物和根瘤菌相互作用的結(jié)果產(chǎn)生了一個高效固氮的共生體-根瘤，在這個過程中，根瘤菌分泌蛋白不僅維持了根瘤菌自身的基礎(chǔ)代謝，而且還對宿主植物的侵染、根瘤的發(fā)育以及宿主專一性方面發(fā)揮了重要作用。

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