劉 楊，黃和璐，董海濤，金 一

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002)

鴿蛋低密度脂蛋白對(duì)冷休克和凍融豬精子HSP70及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

劉 楊，黃和璐，董海濤，金 一*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002)

旨在探究鴿蛋低密度脂蛋白(LDL)對(duì)冷休克和凍融豬精子HSP70及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)分為5組，分別是鮮精組、3%LDL(-80和-196 ℃)處理組、9%LDL(-80和-196 ℃)處理組。采用CASA系統(tǒng)分析不同處理組添加不同濃度鴿蛋LDL對(duì)冷休克及凍融前后豬精子生物學(xué)性狀的影響；通過(guò)SDS-PAGE、Western blotting、PCR擴(kuò)增檢測(cè)分析HSP70蛋白及凋亡基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：豬精子經(jīng)過(guò)凍融處理后，熱休克蛋白HSP70的表達(dá)量高于鮮精組，同時(shí)添加9%鴿蛋LDL并置于-196 ℃保存的凍融精子的熱休克蛋白HSP70的表達(dá)量與鮮精組無(wú)顯著差異(P>0.05)；在抗凋亡基因Bcl-x1、Bcl-2l試驗(yàn)中，鮮精組的基因表達(dá)量均高于其他處理組，添加9%LDL(-196 ℃)處理組的基因表達(dá)量與鮮精組無(wú)顯著差異(P>0.05)；在促凋亡基因Bak試驗(yàn)中，鮮精組的基因表達(dá)量最低，且添加9%LDL(-196 ℃)處理組的Bak基因表達(dá)量與鮮精組無(wú)顯著差異(P>0.05)。添加鴿蛋LDL可在一定程度上降低豬精子在凍融過(guò)程中造成的損傷，維持豬精子正常生物學(xué)性狀，提高豬精子存活率。

豬精子；冷休克；凍融；LDL；HSP70；凋亡相關(guān)基因；

人工授精使用的新鮮精液普遍面臨保存時(shí)間短的難題，釆集的新鮮精液經(jīng)過(guò)洗精稀釋處理，在15～20 ℃條件下只能保存3～5 d[1]，將精液冷凍才能達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。目前關(guān)于牛[2]、羊[3]精液冷凍保存技術(shù)的研究已取得重大進(jìn)展，但在對(duì)豬精液冷凍保存方面的研究較少。J.M.Morrell等[4]研究結(jié)果表明，豬精子細(xì)胞膜的組成成分與牛精子有所不同，主要差異在于豬精子內(nèi)膽固醇與磷脂的比例較低，且細(xì)胞膜內(nèi)外的膽固醇含量不對(duì)稱。降低冷休克對(duì)豬精子的影響，并防止過(guò)氧化物對(duì)精子的損傷是豬精子冷凍保存的關(guān)鍵。冷凍解凍后豬精子細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致精子細(xì)胞膜破損、膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，使精子質(zhì)量嚴(yán)重下降[5]。為了更好地適應(yīng)低溫環(huán)境，維持自身正常的生命代謝，精子內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列變化[6]，如溫度和滲透壓的變化等。但豬冷凍精液在解凍后仍存在活率低、受胎率低、窩平均產(chǎn)仔數(shù)少[7-8]的現(xiàn)象，因此尋找合適的冷凍保護(hù)劑是豬精液冷凍保存的主要研究方向。

卵黃是精液稀釋液的常規(guī)組分，卵黃中對(duì)精子起保護(hù)作用的有效成分是磷脂和低密度脂蛋白(LDL)[9]。侯麗鵬等[10]報(bào)道，鴕鳥(niǎo)蛋中提取的LDL對(duì)冷凍后的豬精子有一定保護(hù)作用，其中添加8 g·mL-1的LDL的效果最好，但鴕鳥(niǎo)蛋中提取的LDL的冷凍保護(hù)效果并沒(méi)有鴿蛋和雞蛋理想。

在凍融過(guò)程中，精子由于應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生HSP70(Heat stress protein 70)，HSP70是由一個(gè)單一外顯子編碼的含有641個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[11]，可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)外界損傷的耐受程度，維持細(xì)胞的正常代謝功能，且與哺乳動(dòng)物精子的生成密切相關(guān)[12]。目前對(duì)熱應(yīng)激蛋白的研究主要集中在人類及其他動(dòng)物的疾病方面，而對(duì)于熱應(yīng)激蛋白作用于精子的研究還處于起步階段。S.Y.Huang等[13]分析了HSP70的表達(dá)量和豬精液質(zhì)量之間的關(guān)系，結(jié)果顯示在較為炎熱的季節(jié)，豬精子內(nèi)HSP70的表達(dá)水平顯著降低，這可能與精液質(zhì)量有關(guān)。M.D.Dun等[14]研究發(fā)現(xiàn)HSP70與新生多肽相關(guān)聯(lián)，有助于蛋白質(zhì)折疊，并且能夠在精子形成期間完成蛋白質(zhì)組裝。S.Nikbin等[15]研究結(jié)果表明，在熱帶地區(qū)HSP70的單核苷酸多態(tài)性可能會(huì)不同程度的影響精液品質(zhì)，尤其是對(duì)解凍后的精液品質(zhì)影響很大。M.Yeste等[16]研究也證實(shí)HSP70的表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生一種能夠包裹自身和外來(lái)抗原的新免疫物質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡。1972年J.F.Kerr等[17]根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，首先提出細(xì)胞凋亡(Apoptosis)一詞。Bak基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，但也受到同族的很多基因(如Bcl-2l、Bcl-xl)的影響[18]?？沟蛲龌駼cl-x1、Bcl-2l在人體的各個(gè)組織中都有不同程度的表達(dá)[19]。Bak可以單獨(dú)緩解Bcl-2l、Bcl-x1的抑凋亡活性，并且能夠直接激活凋亡途徑或是作為細(xì)胞死亡過(guò)程中的組成部分被活化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。凍融可導(dǎo)致豬精子的理化特性發(fā)生變化，并造成一定程度的損傷，加速精子死亡過(guò)程[20]。Y.J.Jeong等[18]發(fā)現(xiàn)精子生存能力的延長(zhǎng)可能與促凋亡基因和抗凋亡基因的平衡有關(guān)。目前對(duì)于精液冷凍保存的研究，大多集中于不同稀釋液對(duì)精液冷凍質(zhì)量的影響以及對(duì)適宜冷凍稀釋液配方的研究。關(guān)于在稀釋液中添加不同成分提高精子活力的作用機(jī)理以及影響凍融后精子活力的相關(guān)基因、蛋白及其相互作用原理的研究相對(duì)較少。

本研究通過(guò)探究在凍融條件下向豬精子中添加不同濃度的鴿蛋LDL對(duì)豬精液品質(zhì)、頂體完整性、HSP70表達(dá)以及凋亡基因Bak、Bcl-x1、Bcl-2l表達(dá)的影響，進(jìn)一步為豬冷凍精液保存技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所用豬精液均來(lái)自吉林省延吉市人工授精站的成年健康長(zhǎng)白豬。采集的精液稀釋后用保溫瓶密封存放，在25 ℃條件下，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用于試驗(yàn)的精液必須符合：①顏色為乳白色；②活率>80%；③頂體完整性>75% 3個(gè)條件。

1.2 試驗(yàn)藥品

Tris、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NaHCO3、KH2PO4、Hepes、EDTA、TEMED、二抗(Anti- Rabbit IgG peroxidase conjugate)均購(gòu)自Sigma公司。預(yù)染 Marker、免疫印跡一抗HSP70、純化RNA試劑盒(High pure RNA isolation kit)、SYBR GreenⅠ染料均購(gòu)自北京華夏遠(yuǎn)洋生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse transcription system)購(gòu)自Promega公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

精子自動(dòng)分析儀(Computer aided sperm analysis，CASA)、超高速離心機(jī)、臺(tái)式微量高速離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、旋禍混合器、二氧化碳培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴鍋、電熱恒溫干燥箱、生物顯微鏡、振蕩儀、低溫高速離心機(jī)、垂直電泳槽、石墨半干轉(zhuǎn)膜儀、PCR擴(kuò)增儀。

1.4 溶液配置

PBS配制：NaCl 7.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g (或Na2HPO41.44 g)和K2HPO41.8 g，溶于800 mL蒸餾水，加蒸餾水定容至1 L。保存于4 ℃冰箱中即可。細(xì)胞裂解液配制：100 mL RIPA裂解液(強(qiáng))分裝1 mL·個(gè)-1，使用前加入PMSF，使PSMF的最終濃度為1 mmol·L-1?？贵w稀釋液(TBST緩沖液)：20% Tween 20 1 mL，TBS緩沖液400 mL，混合后即可使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。冷凍基礎(chǔ)液：TRIS 2.42 g、檸檬酸1.48 g、葡萄糖1.1 g 溶于100 mL去離子水中；冷凍基礎(chǔ)Ⅰ液：冷凍基礎(chǔ)液中加20%雞卵黃(v/v)；冷凍基礎(chǔ)Ⅱ液：冷凍基礎(chǔ)液中加9%甘油(v/v)；冷凍基礎(chǔ)Ⅲ液：冷凍基礎(chǔ)液中加入9% LDL；冷凍基礎(chǔ)液中加入3% LDL。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 LDL的提取 釆用M.Moussa等[21]方法提取LDL。收集鴿蛋卵黃，用等體積的NaCL溶液(0.17 mol·L-1)稀釋卵黃，4 ℃攪拌1 h。攪拌均勻后，4 ℃ 10 000 r·min-1離心45 min。取上清液，4 ℃ 10 000 r·min-1離心，至徹底除去卵黃中的顆粒物質(zhì)為止。取上清液加入等體積40%的(NH4)2SO4溶液，4 ℃攪拌1 h。攪拌均勻后，4 ℃ 10 000 r·min-1離心30 min。取上清液，透析6 h，然后4 ℃ 10 000 r·min-1離心30 min，離心分離后的上層漂浮物即為L(zhǎng)DL。

1.5.2 精液冷休克處理 在平衡后的精液中分別加入含有3%和9%鴿蛋LDL的冷凍基礎(chǔ)Ⅲ液，置于計(jì)算機(jī)控制的水浴中，使精液迅速?gòu)氖覝乩鋮s到4 ℃，移至4 ℃冰箱中平衡30 min，靜置待用。

1.5.3 精液凍融處理 精液經(jīng)過(guò)常溫保存液稀釋后，PBS洗滌，800 r·min-1離心10 min，去上清液，分別加入含有3%和9%鴿蛋LDL的冷凍基礎(chǔ)Ⅲ液，用紗布將試管包裹后放入冰箱，緩慢降溫至4 ℃，然后以2∶1(v/v)分別加入冷凍基礎(chǔ)Ⅱ液。混勻后裝入0.5 mL精細(xì)管中，分別置于-80和-196 ℃的低溫環(huán)境凍存。解凍時(shí)從液氮中取出精細(xì)管后快速放入42 ℃的恒溫水浴鍋中，解凍6 s后取出，將精液放入離心管內(nèi)，加入等體積的PBS，800 r·min-1離心10 min，除去上清液，添加等量的PBS重懸，800 r·min-1離心10 min，備用。

1.5.4 豬精子品質(zhì)檢測(cè) 對(duì)新鮮豬精子、冷休克豬精子(未添加LDL組、添加3%LDL和9%LDL組)、凍融豬精子(-80 ℃添加3%LDL和9%LDL組、-196 ℃添加3%LDL和9%LDL組)用CASA系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)為重復(fù)3次以上的試驗(yàn)平均值。

1.5.5 考馬斯亮藍(lán)染色(CBB染色法) 吸取20 μL凍融豬精子：1)-80 ℃下添加3% LDL；2)-196 ℃下添加3% LDL；3)-196 ℃下添加9% LDL；4)-80 ℃下添加9% LDL)，用PBS重懸，涂片后晾干，用CBB染色液染色5 min，用三蒸水沖洗玻片，晾干后封片。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察豬精子頂體完整性。

1.5.6 精子全蛋白的提取 將不同處理組的豬精子用PBS洗滌，離心后用細(xì)胞裂解液重懸，置于搖床上震蕩20 min。裂解后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，-20 ℃凍存待用。

1.5.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 蛋白上樣量為30 μL，電泳條件為5%濃縮膠40 mA，10%分離膠80 mA，電泳3～4 h，觀察溴紛藍(lán)線移動(dòng)至距離凝膠板底部1 cm處即停止電泳，取出凝膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色，脫色。

1.5.8 免疫印跡(Western blotting) 剪20張濾紙和1張PVDF膜，大小與待轉(zhuǎn)印凝膠相同，將濾紙和PVDF膜在轉(zhuǎn)膜液中浸泡20 min。按照陽(yáng)極、10層濾紙、PVDF膜、凝膠、10層濾紙、陰極的順序依次擺放。恒流電轉(zhuǎn)印25 min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，用TBST洗膜，然后加包被液，室溫下平穩(wěn)搖動(dòng)2 h。棄包被液，用TBST洗膜。加入一抗，4 ℃放置12 h，棄一抗，用TBST洗膜。加入二抗，在室溫下平穩(wěn)搖動(dòng)2 h，棄二抗，用TBST洗膜。加入顯色液，避光顯色直到出現(xiàn)條帶，加入雙蒸水終止反應(yīng)，照相保存。1.5.9 PCR引物設(shè)計(jì)及合成 引物由上海生工生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

Table 1 The primer sequence

基因Gene序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductsize登錄號(hào)AccessionNo.GAPDHSenseAntisenseCTGCCCCTTCTGCTGATGCGACAACTTCGGCATCGTGGA151AF017079BakSenseAntisenseACCGACCCAGAGATGGTCACCAGTTGATGCCACTCTCGAA209AJ001204Bcl-21SenseAntisenseGAAACCCCTAGTGCCATCAAGGGACGTCAGGTCACTGAAT196NM214285Bcl-x1SenseAntisenseCTGAATCAGAAGCGGAAACCGGGACGTCAGGTCACTGAA210AF216205

1.6 總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄PCR及瓊脂糖凝膠電泳

采用純化RNA試劑盒(High pure RNA isolation kit)對(duì)不同處理組的豬精子進(jìn)行RNA提取。反轉(zhuǎn)錄PCR按照Reverse Transcription System試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系：TaqDNA聚合酶0.08 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL、dNTP混合物0.4 μL、MgCl20.8 μL、反轉(zhuǎn)錄10×緩沖液2 μL，加無(wú)核酸的水至終體積為20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，57 ℃5 s，72 ℃10 s，循環(huán)數(shù)45～50；梯度擴(kuò)增；40 ℃30 s。分別取5 μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件分析精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性等試驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。通過(guò)方差分析并用Duncans法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理對(duì)豬精液品質(zhì)的影響

結(jié)果表明(表2～4)，不同處理對(duì)冷休克及凍融后豬精液品質(zhì)有不同程度的影響，鴿蛋LDL能對(duì)冷凍解凍后的豬精子活率產(chǎn)生較好的保護(hù)效果，-196 ℃溫度下添加9%鴿蛋LDL對(duì)解凍后豬精子活率、精子運(yùn)動(dòng)能力的保護(hù)作用最強(qiáng)，9%鴿蛋LDL對(duì)冷休克豬精子活率、精子運(yùn)動(dòng)能力的保護(hù)作用最強(qiáng)。

2.2 冷休克及凍融后豬精子頂體完整性評(píng)估

對(duì)不同處理組的冷休克及凍融豬精子用考馬斯亮藍(lán)染色方法染色，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。頂體完整的標(biāo)準(zhǔn)：只有頂體為藍(lán)色，且頂體邊緣光滑的精子為具有完整頂體的精子類型。圖1結(jié)果顯示：冷休克后的豬精子組，除鮮精外，添加9%LDL處理組與其他組相比，具有較好的頂體完整性；圖2結(jié)果顯示：除鮮精外，凍融后的豬精子組，在-196 ℃下添加9%LDL的處理組與其他組相比具有較好的頂體完整性。

2.3 不同處理對(duì)HSP70蛋白表達(dá)量的影響

將5組豬精子樣本進(jìn)行SDS-PAGE分析，用HSP70抗體與酶標(biāo)二抗進(jìn)行處理，用GAPDH 做內(nèi)參，HSP70蛋白的SDS-PAGE結(jié)果以及免疫印跡結(jié)果如圖3，其中2、3、4、5處理組HSP70表達(dá)量略高于鮮精處理組；而4、5處理組間的表達(dá)量差異不明顯；LDL濃度相同時(shí)，-80 ℃溫度下，3、4處理組表達(dá)量高于-196 ℃的2、5處理組，溫度相同時(shí)，添加3%LDL的3、5處理組表達(dá)量高于添加9%LDL的2、4處理組，3處理組表達(dá)量最高，說(shuō)明添加9%LDL、-196℃處理組的凍融精子與鮮精樣本最為相似。

2.4 凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2l和Bak在不同處理組中表達(dá)

采用PCR擴(kuò)增和DNA電泳方法對(duì)5個(gè)處理組樣本抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2l和促凋亡基因Bak進(jìn)行分析(圖4)。結(jié)果顯示，Bcl-xl、Bcl-2l鮮精處理組的基因表達(dá)量均高于其他處理組；添加9%LDL、-196 ℃的Bcl-2l凍融精子處理組的基因表達(dá)量略高于除鮮精外的其他3個(gè)處理組，3%LDL、-80 ℃處理組的基因表達(dá)量最低；添加9%LDL、-196 ℃的Bak凍融精子處理組的基因表達(dá)量略低于除鮮精以外的其他3個(gè)處理組；3%LDL、-196 ℃處理組的基因表達(dá)量最高。

表2 不同處理對(duì)冷休克后豬精液品質(zhì)的影響

Table 2 Effects of different treatments on quality of cold shock pig sperm

項(xiàng)目Item鮮精Freshsperm未添加LDLNotaddLDL添加3%LDLAdd3%LDL添加9%LDLAdd9%LDLA級(jí)精子比例/%ProportionofgradeAsperm65.10±9.33a9.40±1.14b10.10±5.46b18.90±1.52bB級(jí)精子比例/%ProportionofgradeBsperm13.40±1.53a5.30±5.03b4.90±4.28b7.40±3.67abC級(jí)精子比例/%ProportionofgradeCsperm16.00±4.56a38.80±8.68b42.00±5.47b47.50±4.74bD級(jí)精子比例/%ProportionofGradeDsperm5.40±4.01a46.60±0.83b42.90±1.83b26.10±1.71cVCL9/(μm·s-1)43.20±8.69a14.60±1.39b6.70±4.92b17.00±1.40bVSL/(μm·s-1)23.30±2.18a4.90±0.33b3.60±3.50b7.50±1.39bVAP/(μm·s-1)39.30±7.37a12.70±1.98b6.10±4.63b16.10±4.60b

同一行中肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。VCL9.平均曲線運(yùn)動(dòng)速率；VSL.平均直線運(yùn)動(dòng)速率；VAP.平均路徑運(yùn)動(dòng)速率；A級(jí)精子.快速向前運(yùn)動(dòng)的精子；B級(jí)精子.慢速或呆滯向前運(yùn)動(dòng)的精子；C級(jí)精子.非向前運(yùn)動(dòng)精子；D級(jí)精子.極慢或不動(dòng)的精子。下同

Different superscripts letters in the same line represents a significance at (P<0.05)；The same superscripts letters in the same line represents no significant difference(P>0.05).VCL9.Average curvilinear velocity；VSL.Average straight line velocity；VAP.Average path velocity；Grade A sperm.The sperm of fast forward movement；Grade B sperm.The sperm of slow or dead to move forward；Grade C sperm.The sperm of not fast forward movement；Grade D sperm.The sperm of extremely slow or does not move.The same as below

表3 不同處理對(duì)凍融豬精液品質(zhì)的影響

Table 3 Effects of different treatments on quality of frozen-thawed boar sperm

項(xiàng)目Item鮮精Freshsperm-80℃-196℃3%LDL9%LDL3%LDL9%LDLA級(jí)精子比例/%ProportionofGradeAsperm65.10±9.33a3.20±0.40b5.50±3.46b3.40±1.47b11.40±2.13bB級(jí)精子比例/%ProportionofGradeBsperm13.40±1.53a5.90±1.94b6.60±1.79b7.00±0.52b13.60±0.83bC級(jí)精子比例/%ProportionofGradeCsperm16.00±4.56a16.50±1.74a18.40±2.74a18.00±1.57a25.50±1.20abD級(jí)精子比例/%ProportionofGradeDsperm5.40±4.01a74.20±1.27b69.50±0.67c71.50±0.31bc50.30±0.67dVCL9/(μm·s-1)43.20±8.69a17.20±1.15b18.60±4.57b18.40±2.37b19.20±0.38bVSL/(μm·s-1)23.30±2.18a6.30±0.67b8.30±2.83b7.60±2.77b9.70±1.05bVAP/(μm·s-1)39.30±7.37a15.00±0.99b16.50±4.22b16.30±1.91b18.70±0.24b

表4 鮮精和添加LDL的凍融后豬精液品質(zhì)

Table 4 Sperm quality of fresh and LDL supplemented frozen-thawed boar semen

%

a.鮮精；b.未加LDL；c.添加3% LDL；d.添加9% LDL a.Fresh sperm；b.Not add LDL；c.Add 3% LDL；d.Add 9% LDL圖1 不同處理的冷休克豬精子考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果 20×Fig.1 CBB staining on boar cold shock sperm with different treatments 20×

a.鮮精；b.3% LDL(-80℃)；c.9% (-196℃)；d.3% LDL(-196℃)；e.9% LDL(-80℃)a.Fresh sperm；b.3% LDL(-80℃)；c.9%(-196℃)；d.3% LDL(-196℃) ；e.9% LDL(-80℃)圖2 不同處理的凍融豬精子考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果 20×Fig.2 CBB staining on boar frozen-thawed sperm with different treatments 20×

M.Marker；1.鮮精；2.9% LDL(-196℃)；3.3% LDL(-80℃)；4.9% LDL(-80℃)；5.3% LDL(-196℃)。下同M.Marker；1.Fresh sperm；2.9%LDL(-196 ℃)；3.3%LDL(-80 ℃) ；4.9%LDL(-80 ℃)；5.3% LDL(-196 ℃).The same as Fig.4圖3 5種處理豬精子HSP70蛋白表達(dá)的免疫印跡結(jié)果Fig.3 The results of the expression of HSP70 with 5 treatments by Western blotting

圖4 5種處理組豬精子凋亡基因的PCR結(jié)果Fig.4 The results of apoptotic gene with 5 treatments by PCR

3 討 論

3.1 溫度和鴿蛋LDL對(duì)豬精子品質(zhì)和頂體完整性的影響

精子活力及其運(yùn)動(dòng)性在凍融后普遍下降是因?yàn)閮鋈趯?duì)精子內(nèi)的抗氧化酶造成持續(xù)性傷害，并引發(fā)更多活性氧(ROS)的產(chǎn)生，活性氧自由基會(huì)使精子膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷、凋亡甚至使精子基因變化。而LDL可在凍融過(guò)程中保護(hù)精子內(nèi)抗氧化酶的活性，從而有效提高精子活率。S.Büyükleblebici等[22]研究結(jié)果表明，在精液中補(bǔ)充不同抗氧化劑能夠降低頂體異常率。卵黃中對(duì)精子起冷凍保護(hù)作用的有效成分是磷脂和低密度脂蛋白(LDL)[23]。在豬精液的冷凍保存過(guò)程中，添加LDL能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，且對(duì)豬精子的活率以及活動(dòng)能力都有一定的保護(hù)作用[24]。本研究結(jié)果表明，添加9%鴿蛋LDL并置于-196 ℃的處理組對(duì)冷休克以及凍融后的豬精子活率、精子運(yùn)動(dòng)能力的保護(hù)作用最強(qiáng)。這與呂瑞凱等[25]研究證實(shí)的添加0.09 g·mL-1鴿蛋LDL的凍存豬精子解凍后，精子活率達(dá)到47.33%，頂體完整性達(dá)到62.57%結(jié)果基本相似，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于鴿蛋 LDL含有的特殊結(jié)構(gòu)，LDL含有0%～15%的蛋白質(zhì)和85%～90%的脂質(zhì)，并以甘油三酯為核形成一種膜狀物[26]。精子在凍融過(guò)程中，鴿蛋LDL的結(jié)構(gòu)損壞并破裂，使其內(nèi)部的甘油三酯和磷脂進(jìn)入精液，并在精子細(xì)胞外壁形成凝膠膜，以此降低凍融過(guò)程中物理和化學(xué)因素對(duì)精子造成的損傷。

3.2 溫度和鴿蛋LDL對(duì)HSP70表達(dá)的影響

熱休克蛋白具有的一些內(nèi)在和外在因素可能導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)損傷，阻礙蛋白質(zhì)合成，干擾細(xì)胞周期并引起細(xì)胞非正常凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致精子異常[27]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加9%鴿蛋LDL并置于-196 ℃條件下處理組凍融精子的HSP70表達(dá)量與鮮精樣本最為相似，并且隨著溫度的降低，HSP70的表達(dá)量逐漸降低，這與王艷風(fēng)[28]提出的隨著冷凍過(guò)程的進(jìn)行，HSP70基因的表達(dá)量逐漸降低，而新鮮精子的基因表達(dá)量顯著高于平衡后的精子(P<0.05)，平衡后精子基因的表達(dá)量又顯著高于解凍后的精子(P<0.05)的結(jié)論相似。說(shuō)明豬精子在凍融過(guò)程中受到冷凍損傷后促使HSP70蛋白表達(dá)，這可能是由于細(xì)胞受到應(yīng)激傷害后，HSP70以分子伴侶的身份與異常蛋白質(zhì)分子的親水表面緊密結(jié)合，保護(hù)蛋白分子構(gòu)型以維持正常細(xì)胞的生存功能。添加9%鴿蛋LDL處理組的HSP70的表達(dá)量比添加3%鴿蛋LDL處理組的表達(dá)量高，這與D.Kong等[29]研究的添加9%鴿蛋LDL，200 mmol·L-1的海藻糖，9%甘油組合能保護(hù)凍融后精子的結(jié)果相似，說(shuō)明鴿蛋LDL能夠在凍融過(guò)程中保護(hù)豬精子內(nèi)抗氧化酶的活性，避免精子損傷。江中良[30]研究LDL對(duì)豬精子凍融后凋亡樣變化產(chǎn)生的影響后證實(shí)，在豬精液冷凍稀釋液中添加不同濃度(6%～10%)的LDL，對(duì)促進(jìn)豬冷凍解凍后精子的存活，降低冷凍解凍誘導(dǎo)的凋亡樣變化以及與凋亡相關(guān)的部分基因的表達(dá)有明顯作用。HSP70的保護(hù)作用是通過(guò)促進(jìn)變性蛋白的復(fù)性來(lái)維持蛋白的正常結(jié)構(gòu)，或水解變性蛋白以促進(jìn)新老蛋白交替實(shí)現(xiàn)的。因此從各個(gè)角度深入研究HSP70對(duì)免疫學(xué)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抗氧化、胚胎發(fā)育、調(diào)控細(xì)胞周期等多個(gè)方面都將有重要意義。

3.3 溫度和鴿蛋LDL對(duì)豬精子抗凋亡基因Bcl-2l、Bcl-xl和促凋亡基因Bak表達(dá)的影響

研究表明，凍融可使人[31]、牛[32]精子細(xì)胞活性降低、線粒體膜電位降低等與細(xì)胞凋亡相關(guān)特征的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞中Bax基因表達(dá)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞凋亡加速。這似乎表明，Bax與Bcl-2l會(huì)組成異質(zhì)二聚體，進(jìn)而抑制Bcl-2l蛋白對(duì)細(xì)胞存活的影響[33]?？沟蛲龌駼cl-2l成員中的BH3結(jié)構(gòu)域是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)域，可封閉促凋亡基因，并且從根本上阻止Bax和Bak基因的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生[33]。在本研究中，用PCR擴(kuò)增的方法分析凍融處理后豬精子凋亡基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示在抗凋亡基因Bcl-xl和Bcl-2l處理組中，鮮精處理組的基因表達(dá)量高于其他處理組，添加9%LDL、-196 ℃條件下凍融精子處理組的Bcl-xl、Bcl-2l基因表達(dá)量與鮮精組相似，說(shuō)明在此溫度下9%鴿蛋LDL能夠降低細(xì)胞損傷，阻礙細(xì)胞凋亡，這與江中良[30]首次提出在冷凍保存后的豬精液中添加9%～10%的LDL后，BCL-2l的基因表達(dá)量顯著上升的結(jié)論基本相似。添加9%LDL、-196 ℃的Bak基因凍融精子處理組的基因表達(dá)量略低于除鮮精以外的其他3個(gè)處理組。這一結(jié)果似乎也表明凍融誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡廣泛存在，并與Y.J.Jeong等[24]研究發(fā)現(xiàn)的凍融過(guò)程可以誘導(dǎo)精子的凋亡相一致。似乎說(shuō)明精子存活能力的延長(zhǎng)可能與促凋亡基因和抗凋亡基因的平衡有關(guān)。造成以上原因的結(jié)果還需更深層次的研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)各處理組中豬精子熱休克蛋白HSP70的表達(dá)量均高于鮮精組，其中添加9%鴿蛋LDL、-196 ℃凍融精子熱休克蛋白HSP70的表達(dá)量與鮮精組無(wú)顯著差異；在抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2l處理組中，鮮精處理組的基因表達(dá)量均高于其他處理組；而添加9%LDL、-196 ℃凍融精子處理組Bcl-2l基因的表達(dá)量與鮮精相似；添加9%LDL、-196 ℃凍融精子處理組的Bak基因表達(dá)量與鮮精最接近；且添加3%LDL、-196 ℃凍融處理組的Bak基因的表達(dá)量最高。

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(編輯 程金華)

Effect of LDL from Pigeon Egg Yolk on the Expression of HSP70 and Apoptosis-related Gene in Cold Shock and Frozen-thawed Boar Spermatozoa

LIU Yang，HUANG He-lu，DONG Hai-tao，JIN Yi*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，Yanji133002，China)

The purpose of this study is to investigate the effects of LDL from pigeon egg yolk on expression of HSP70 and apoptosis related genes in cold-shocked and frozen-thawed boar spermatozoa.This study divided into 5 groups：fresh sperm group，3% LDL(-80 and -196 ℃) treatment groups，9%LDL(-80 and -196 ℃)treatment groups.The addition of LDL with different concentrations has effect on biological features of the spermatozoa before and after cold-shock and frozen-thawed treatments ，which was analysed by CASA，and changes in expression of HSP70 and apoptosis-related genes were analysed and checked by SDS-PAGE，Western blotting and PCR.The results showed that：HSP70 expression was higher than that of fresh sperm after freezing，there was no significant difference between HSP70 expression of frozen-thawed stored at -196 ℃ with addition of 9% pigeon egg and fresh spermatozoa in treatment group(P>0.05)；in the experiment of anti-apoptosis geneBcl-x1，Bcl-21，gene expression in fresh sperm treatment group was higher than other treatment groups(P>0.05)；in the expression of pro-apoptoticBakgene，the expression of fresh sperm was the lowest，there was no significant difference betweenBakgene of the 9% LDL(-196 ℃) treatment group and fresh spermatozoa in treatment group(P>0.05).Addition of LDL from pigeon egg yolk could reduce the damage caused by freezing and thawing，maintain biological features and improve the survival of the pig spermatozoa.

boar spermatozoa；cold shock；LDL；frozen-thawed；HSP70；apoptosis-related gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.009

2015-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260529)；吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204079NY)

劉 楊(1990-)，女，青海人，碩士生，主要從事動(dòng)物繁殖與生物技術(shù)研究，E-mail：599295340@qq.com

*通信作者：金 一，教授，E-mail：yijin@ybu.edu.cn

S813.3

A

0366-6964(2015)06-0940-09