薩茹麗，木其爾，王翠芳，包玲玲，敖長(zhǎng)金*，王思珍

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，通遼 028000)

沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖及IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達(dá)的影響

薩茹麗1，木其爾1，王翠芳1，包玲玲1，敖長(zhǎng)金1*，王思珍2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，通遼 028000)

本試驗(yàn)以綿羊外周血淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象，研究沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率，IL-2、IL-4、IFN-γ基因mRNA表達(dá)量的影響，為全面揭示沙蔥黃酮的免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。試驗(yàn)采用MTT法研究沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響，使用RT-PCR法研究沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IFN-γ基因mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，沙蔥黃酮具有促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的作用，對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用，可上調(diào)IFN-γmRNA表達(dá)，下調(diào)IL-4 mRNA表達(dá)。綜上，沙蔥黃酮具有促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖及免疫調(diào)節(jié)活性的作用。

沙蔥黃酮；淋巴細(xì)胞增殖；IL-2；IL-4；IFN-γ

沙蔥又名蒙古韭，主要生長(zhǎng)于我國(guó)西北部荒漠化草原，是一種抗寒抗旱能力極強(qiáng)的百合科蔥屬植物[1]。研究表明，沙蔥及其提取物在抗氧化[2-3]、抗菌及提高畜產(chǎn)品品質(zhì)[4-5]、改善家畜免疫機(jī)能[6-7]等方面具有較好的生物功效。沙蔥黃酮(AlliumMongolicumRegelFlavonoids，AMF)是由沙蔥嫩葉中分離得到的一種天然植物提取物[8]。趙春艷等研究表明，沙蔥黃酮具有較好的抗氧化活性[9]及免疫調(diào)節(jié)活性[10]。

本試驗(yàn)欲通過(guò)體外試驗(yàn)觀察沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達(dá)的影響，旨在為沙蔥黃酮類化合物的深入研究與相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

沙蔥黃酮參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法由本實(shí)驗(yàn)室自制。

羊外周血淋巴細(xì)胞分離液為天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)；胎牛血清、RPMI-1640為Gibico公司生產(chǎn)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、β-巰基乙醇、刀豆蛋白A(ConA)等均為Sigma公司產(chǎn)品；磷酸鹽緩沖液(PBS)為Hyclone 公司生產(chǎn)；RNA iso plus(D9108B)、SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(DRR820A)、Prime Script@RT Master Mix Perfect Real Time (DRR036S)、DL2000 DNA Marker(D501A)、DL500 DNA Marker(D525A)、pMD 19-T Vector(D102A)等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

HEPA class 100 CO2培養(yǎng)箱；BIOTEK Synergy H4型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀；ESCO AC2-4S1生物安全柜；Olympus IX71倒置相差顯微鏡；Nikon YS100普通光學(xué)顯微鏡公司；Bio-Rad iQ5 Multicolor 熒光定量PCR儀；TGRADIENT梯度PCR儀等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綿羊外周血淋巴細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[11]的方法，無(wú)菌采集健康蒙古綿羊頸靜脈血，血液采用肝素鈉抗凝。1 500 r·min-1離心10 min后去除血清，將血漿與PBS等比例混勻，取5 mL緩慢鋪在分裝于玻璃離心管的羊淋巴細(xì)胞分離液(4 mL)上，3 000 r·min-1離心40 min，中間白色霧狀層即為綿羊外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)層，取PBMC用PBS洗滌兩次，加入含10% FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，收集未貼壁細(xì)胞并重懸于RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，即得到綿羊外周血淋巴細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，確定細(xì)胞存活率>95%后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)·mL-1，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響 試驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，對(duì)照組為50 μL綿羊外周血淋巴細(xì)胞懸液加入50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液；試驗(yàn)組分為高、中、低計(jì)量組，分別為50 μL綿羊外周血淋巴細(xì)胞懸液加入50 μL含不同濃度沙蔥黃酮的細(xì)胞培養(yǎng)液(10 mg沙蔥黃酮溶于10 mL RPMI-1640中，0.22 μm濾器過(guò)濾除菌后分別稀釋至200、100、50 μg·mL-1)于96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)6、12、24、48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)結(jié)束后用平板離心機(jī)2 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩搖勻后570 nm處測(cè)定各孔吸光度值。

1.3.3 沙蔥總黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響

1.3.3.1 試驗(yàn)分組與細(xì)胞處理：試驗(yàn)分為對(duì)照組與試驗(yàn)組，對(duì)照組為1 mL綿羊外周血淋巴細(xì)胞懸液加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液；試驗(yàn)組分為高、中、低劑量組，分別為1 mL綿羊外周血淋巴細(xì)胞懸液加入1 mL不同濃度沙蔥黃酮的細(xì)胞培養(yǎng)液(10 mg沙蔥黃酮溶于10 mL RPMI-1640中，0.22 μm濾器過(guò)濾除菌后分別稀釋至200、100、50 μg·mL-1)。按試驗(yàn)分組要求將各組細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，1 500 r·min-1離心10 min，收集沉淀。在所得細(xì)胞沉淀中加入4 mL PBS反復(fù)吹打混勻后1 500 r·min-1離心10 min，去掉上清，收集沉淀(此步驟重復(fù)2～3次)。

1.3.3.2 總RNA的提?。喊凑誖NA提取試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取。提取所得細(xì)胞總RNA樣品使用Synergy H4多功能酶標(biāo)儀測(cè)定其 A260 nm/A280 nm值，選擇A260 nm/A280 nm值為1.8～2.2的樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)或凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.3.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書并結(jié)合趙飛艷等[12]報(bào)道方法進(jìn)行。

1.3.3.4 引物合成：β-actin、IL-2、IL-4、IFN-γ基因引物序列同趙飛艷等[12]所報(bào)道引物序列一致，由大連寶生物公司合成(表1)。

1.3.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：用iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)液的組分與配制見表2。β-actin、IL-2、IL-4與IFN-γ基因的反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

Table 1 Primers sequence and product size

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductsizeβ-actinforwardβ-actinreverseIL-2forwardIL-2reverseIL-4forwardIL-4reverseIFN-γforwardIFN-γreverseCCCATTGAGCACGGCATTGCAGGGGTGTTGAAGGTCTCTGTCTTGCATTGCACTAACTCTTGTTCTTTCATTGTGTTCCCCGTAGAATTGAGCTTAGGCGTATCTACAGGTACTCGTCTTGGCTTCATTCACAAATCTAACCTCAGAAAGCGGAAGAGCAGGCAGGAGAACCATTAC1858012281

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)液的組分與配制

Table 2 The component of quantitative PCR reaction solution

試劑Reagents使用量/μLUsageamountSYBRPremixEXTaqTMⅡ(2×)12.5PCRForwardPrimer(10μmol·L-1)1.0PCRReversePrimer(10μmol·L-1)1.0cDNA2.0ddH2O8.5Total25.0

1.3.3.6 基因 mRNA 表達(dá)水平相對(duì)定量與分析：本試驗(yàn)采用比較閾值法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析[13]。反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)將熒光信號(hào)強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為基因的Ct值，統(tǒng)計(jì)時(shí)對(duì)每個(gè)基因的3個(gè)重復(fù)取平均值記為Ct 值。目的基因的相對(duì)表達(dá)量可以根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算：2-ΔΔCt=2-[(試驗(yàn)組目的基因Ct-試驗(yàn)組管家基因Ct)-(對(duì)照組目的基因Ct-對(duì)照組管家基因Ct)]

其中，2-△△Ct表示目的基因的相對(duì)mRNA 表達(dá)量。將對(duì)照組的2-△△Ct值設(shè)為1，各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)同對(duì)照組進(jìn)行比較定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響

表3所示，隨著沙蔥黃酮濃度的增加各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，淋巴細(xì)胞增殖率呈逐漸上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為6h時(shí)各試驗(yàn)組淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，同時(shí)高、中劑量組淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于低劑量組(P<0.01)；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間由6h延長(zhǎng)至12h時(shí)各試驗(yàn)組淋巴細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.01)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間由12h繼續(xù)延長(zhǎng)至24h時(shí)，低劑量組淋巴細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.01)，中劑量組與高劑量組淋巴細(xì)胞增殖率無(wú)顯著變化(P>0.05)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至48h時(shí)，各組淋巴細(xì)胞增殖率與24h時(shí)淋巴細(xì)胞增殖率無(wú)顯著改變(P>0.05)。由此可知，沙蔥黃酮具有促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的作用，且混合培養(yǎng)時(shí)間為12h時(shí)此作用最為明顯，后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著變化；并且可以看出中劑量沙蔥黃酮即濃度為100μg·mL-1時(shí)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用最好。

2.2 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響

2.2.1 綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IFN-γ及β-actin熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞中各基因影響的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線和熔解曲線見圖1～3，圖中a為基因擴(kuò)增曲線，b為基因熔解曲線，其中A為目的基因，B為內(nèi)參基因β-actin。由圖可知，各基因擴(kuò)增情況良好，擴(kuò)增曲線平滑，呈現(xiàn)典型的S型，熔解曲線為單一峰型，并且峰型比較銳利，說(shuō)明各擴(kuò)增的目的基因片段長(zhǎng)度一致，不含引物二聚體及其他雙鏈DNA污染，可用于相對(duì)定量分析。

表3 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響

Table 3 The effects of AMF on proliferation of lymphocytes in sheep

組別Group6h12h24h48h對(duì)照組Control0.284±0.019aA0.305±0.035bA0.302±0.035aA0.301±0.048bA低劑量組(50μg·mL-1)Lowdose0.328±0.016aB0.361±0.037cB0.354±0.034bB0.352±0.012bB中劑量組(100μg·mL-1)Moderatedose0.350±0.004aC0.386±0.021bD0.381±0.037bC0.385±0.023bD高劑量組(200μg·mL-1)Highdose0.352±0.071aC0.372±0.011bC0.377±0.078bC0.374±0.035bC

同行數(shù)據(jù)后肩注小寫字母不同表示數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)，同列數(shù)據(jù)后肩注大寫字母不同表示數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)

The different lower case letters in the same row indicate significant difference(P<0.01)，the different uppercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.01)

圖1 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2基因qPCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線(a)和熔解曲線(b)Fig.1 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IL-2 gene

圖2 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-4基因qPCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線(a)和熔解曲線(b)Fig.2 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IL-4 gene

圖3 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IFN-γ基因qPCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線(a)和熔解曲線(b)Fig.3 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IFN-γ gene

2.2.2 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響 由表4可知各劑量組沙蔥黃酮對(duì)IL-2 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響；各試驗(yàn)組IL-4 mRNA的表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，且各濃度組間比較差異均為極顯著(P<0.01)。說(shuō)明沙蔥黃酮具有下調(diào)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA表達(dá)的作用，且這種下調(diào)作用與濃度呈正相關(guān)。比較各試驗(yàn)組對(duì)IFN-γmRNA表達(dá)的結(jié)果可知，各濃度沙蔥黃酮均可上調(diào)IFN-γmRNA的基因表達(dá)，與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，高劑量組與中、低劑量組比較差異極顯著(P<0.01)，中劑量組與低劑量組比較有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明沙蔥黃酮對(duì)IFN-γmRNA表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用，且這種促進(jìn)作用與劑量呈正相關(guān)。

表4 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響

Table 4 Effects of the AMF on sheep peripheral blood lymphocyte’sIL-2，IL-4 andIFN-γmRNA expression

組別GroupIL-2IL-4IFN-γ對(duì)照組Control11a1a低劑量組(50μg·mL-1)0.994±0.0150.752±0.044b2.237±0.045b中劑量組(100μg·mL-1)1.087±0.0130.554±0.003c2.484±0.021bc高劑量組(200μg·mL-1)1.100±0.0030.144±0.005d3.394±0.174d

同列數(shù)據(jù)肩注小寫字母不同表示數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)

The different lower case letters indicate significant difference(P<0.01)

3 討 論

3.1 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響作用

淋巴細(xì)胞增殖能力是反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫水平的重要指標(biāo)之一[14]，且淋巴細(xì)胞的增殖狀態(tài)與機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)成正相關(guān)[15]。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)因其所需時(shí)間較短、試驗(yàn)條件穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)成為免疫增強(qiáng)藥物的初步篩選、活性強(qiáng)弱評(píng)定以及作用機(jī)理研究的首選方法[16]。諸多研究報(bào)道顯示，黃酮類化合物具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的活性，如楊秀松等研究報(bào)道金花葵粗黃酮具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，可有效促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖、增加單核細(xì)胞吞噬指數(shù)[17]。徐璐等研究報(bào)道表明，黃芪總黃酮能顯著增強(qiáng)小鼠的免疫功能，可顯著提高小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能、血清溶血素水平，促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)[18]。辛歡歡等研究白花蛇舌草黃酮注射液對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)白花蛇舌草黃酮可以有效促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的分泌[19]。除此之外大量研究表明，沙蔥及其提取物可促進(jìn)機(jī)體免疫機(jī)能，沙蔥多糖可以顯著提高綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖、具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著沙蔥黃酮濃度的增加與共同培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，淋巴細(xì)胞增殖率呈逐漸上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，表明沙蔥黃酮具有促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的作用，且混合培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)、添加劑量為100 μg·mL-1時(shí)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用較好。這可能是因?yàn)樯呈[黃酮中含有3′，4′-環(huán)氧基-7-O-5-甲氧基黃酮醇與7-O-5，4′-二甲氧基-3′-羥基黃酮等黃酮類物質(zhì)[20]，這些黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)與雌激素類同，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。除此之外沙蔥黃酮分子結(jié)構(gòu)中C2=C3雙鍵也是沙蔥黃酮具有免疫調(diào)節(jié)活性的原因之一[20]。

3.2 沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞因子是指生物機(jī)體在炎癥與免疫應(yīng)答過(guò)程中產(chǎn)生的一系列具有免疫調(diào)節(jié)活性的小分子多肽或蛋白質(zhì)，而這些細(xì)胞因子均由其特定的免疫細(xì)胞表達(dá)分泌[21]。當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)因素如病毒、細(xì)菌或其他病原微生物的侵害時(shí)機(jī)體會(huì)啟動(dòng)其天然免疫和特異性免疫效應(yīng)機(jī)制，而細(xì)胞因子就是介導(dǎo)這些效應(yīng)機(jī)制的分子。T細(xì)胞分泌和轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞因子是特異性免疫應(yīng)答的激活階段，而IL-2、IL-4和IFN-γ等是啟動(dòng)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子，其中，IL-2主要來(lái)源于T細(xì)胞以及T細(xì)胞系，具有誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生多種淋巴因子，促進(jìn)B細(xì)胞和殺傷性NK細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)抗體合成等生物功效[22]。IL-4主要來(lái)源于CD4+T細(xì)胞，具有促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)、B細(xì)胞分化以及參與單核吞噬細(xì)胞的活化與抑制作用。IFN-γ也稱為免疫干擾素，具有直接促進(jìn)T、B細(xì)胞分化，激活NK細(xì)胞，增強(qiáng)TNF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，還具有增強(qiáng)細(xì)胞核體液免疫應(yīng)答，激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬能力除去病原微生物與癌變細(xì)胞等作用。黃酮類化合物作為植物天然有效成分具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，且其免疫調(diào)節(jié)活性已經(jīng)成為黃酮類化合物研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。唐浩國(guó)等研究報(bào)道，竹葉黃酮在0～80 μg·mL-1可顯著提高小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞增殖率并且促進(jìn)脾細(xì)胞IFN-γ基因mRNA表達(dá)，促進(jìn)T和B淋巴細(xì)胞的增殖與分化，顯著增強(qiáng)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用[23]。徐波等研究報(bào)道稱地錦草總黃酮可有效提高機(jī)體免疫機(jī)能，并有效促進(jìn)免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ等基因的mRNA表達(dá)[24]。朱兆榮等研究報(bào)道，復(fù)方苦芩可有效增強(qiáng)小鼠非特異性免疫功能，同時(shí)能夠降低犬血清細(xì)胞因子IL-4含量及其mRNA表達(dá)，升高犬血清IFN-γ含量及其mRNA表達(dá)[25]。楊曉航等研究報(bào)道，黃芪總黃酮具有調(diào)節(jié)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠外周血細(xì)胞因子表達(dá)水平的作用[26]。基于本試驗(yàn)研究結(jié)果認(rèn)為，沙蔥黃酮對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。這種生物活性可能與其獨(dú)特的生物分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，其所含的3′，4′-環(huán)氧基-7-O-5-甲氧基黃酮醇與7-O-5，4′-二甲氧基-3′-羥基黃酮等黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中C2=C3結(jié)構(gòu)和類雌激素結(jié)構(gòu)等均是免疫增強(qiáng)結(jié)構(gòu)基團(tuán)，這些基團(tuán)作用于淋巴細(xì)胞后，通過(guò)上調(diào)綿羊外周血淋巴細(xì)胞中IFN-γmRNA的表達(dá)，下調(diào)IL-4 mRNA的表達(dá)起到有一定的體外免疫調(diào)節(jié)作用，但其具體分子信號(hào)通路以及作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

基于上述研究結(jié)果，推測(cè)沙蔥黃酮發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的部分機(jī)制：通過(guò)促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖，上調(diào)IFN-γmRNA表達(dá)，下調(diào)IL-4 mRNA表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對(duì)綿羊的免疫調(diào)節(jié)活性。

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(編輯 郭云雁)

Effect ofAlliumMongolicumRegelFlavonoidson Lymphocyte Proliferation，mRNA Expression ofIL-2，IL-4，IFN-γin Peripheral Blood Lymphocyte of Sheep

SA Ru-li1，MU Qi-er1，WANG Cui-fang1，BAO Ling-ling1，AO Chang-jin1*，WANG Si-zhen2

(1.CollegeofAnimalScience，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，InnerMongoliaUniversityfortheNationalities，Tongliao028000，China)

In order to study the action mechanism ofAlliumMongolicumRegelFlavonoids(AMF) on immunological enhancement activity，the effects of AMF on lymphocyte proliferation and mRNA expression ofIL-2，IL-4 andIFN-γwere determined by MTT method and real-time fluorescent quantitation PCR assay.The peripheral blood lymphocyte of sheep was used in this study.The results showed that AMF could significantly enhance lymphocyte proliferation.AMF could significantly up-regulate mRNA expression ofIFN-γ，down-regulate mRNA expression ofIL-4，and have no significantly effect onIL-2 mRNA expression.The result indicate that AMF has immunoregulatory activity and could enhance lymphocyte proliferation.

AlliumMongolicumRegelFlavonoids；lymphocyte proliferation；IL-2；IL-4；IFN-γ

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.024

2014-09-05

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(31260558；31160474)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAD10B04)

薩茹麗(1986-)，女，內(nèi)蒙古自治區(qū)興安盟人，博士生，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)研究，E-mail：qisaruli@126.com

*通信作者：敖長(zhǎng)金，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究，E-mail：changjinao@aliyun.com

S826；S813.3

A

0366-6964(2015)06-1063-08