吳正常，戴超輝，殷學(xué)梅，孫壽永，2，包文斌，2*，吳圣龍，2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省種豬繁育和健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，揚(yáng)州 225009)

豬LTβR基因克隆、結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)、組織表達(dá)譜分析及真核表達(dá)載體構(gòu)建

吳正常1，戴超輝1，殷學(xué)梅1，孫壽永1，2，包文斌1，2*，吳圣龍1，2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省種豬繁育和健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，揚(yáng)州 225009)

為了進(jìn)一步探究豬LTβR基因的生物學(xué)功能，本研究以豬淋巴組織cDNA為模板擴(kuò)增LTβR基因CDS區(qū)，進(jìn)一步利用生物信息學(xué)對(duì)豬LTβR蛋白結(jié)構(gòu)與功能以及參與的GO和Pathway通路進(jìn)行分析，利用Real-time PCR檢測(cè)LTβR基因在大白豬不同組織中的表達(dá)水平，同時(shí)將LTβR基因擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，并分別轉(zhuǎn)染豬HEK293和IPEC-J2小腸上皮細(xì)胞系，通過(guò)顯微鏡觀察其表達(dá)情況。結(jié)果表明，克隆獲得豬LTβR基因CDS區(qū)全長(zhǎng)為1 209 bp，編碼402個(gè)氨基酸，發(fā)現(xiàn)LTβR為脂溶親水性的不穩(wěn)定蛋白，存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(205～227 aa)，不存在信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位表明LTβR為非分泌型蛋白。LTβR蛋白具有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，18個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10種保守的特異性蛋白質(zhì)激酶的結(jié)合位點(diǎn)。該蛋白保守區(qū)域?yàn)?個(gè)TNFR superfamily，分別位于32～125和128～192位氨基酸，并發(fā)現(xiàn)C422T>A141V突變位于該區(qū)域內(nèi)。KEGG和GO分析發(fā)現(xiàn)，LTβR基因共參與12項(xiàng)GO功能分類，同時(shí)還參與NF-kappa B信號(hào)通路、IgA 合成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等5項(xiàng)調(diào)控通路。定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LTβR基因在大白豬肺中的表達(dá)水平極顯著高于其他組織(P<0.01)，在腎和脾等免疫器官，十二指腸和空腸等腸道組織中也均有較高的表達(dá)水平。細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染試驗(yàn)及顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其在豬HEK293和IPEC-J2兩種細(xì)胞中均表達(dá)。本研究為豬LTβR基因及其介導(dǎo)的信號(hào)通路的功能分析提供了材料和依據(jù)，今后有必要在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證分析豬LTβR基因及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在豬抵抗細(xì)菌感染過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，同時(shí)將C422T突變作為豬抗病育種的一個(gè)潛在遺傳標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)分析。

豬；LTβR基因；克?。徽婧吮磉_(dá)載體；蛋白結(jié)構(gòu)與功能

腸道是動(dòng)物防止感染的第一道防線，腸道內(nèi)各種免疫成分為其提供多方面、多層次的防護(hù)，構(gòu)成了嚴(yán)密的免疫屏障，這就是腸道免疫系統(tǒng)，也叫黏膜免疫系統(tǒng)。腸道免疫系統(tǒng)是由免疫細(xì)胞、免疫球蛋白(IgA)及腸道微生物組成，其中豬腸道系統(tǒng)功能中起關(guān)鍵作用的是由B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞后產(chǎn)生的IgA，它是腸道免疫屏障的一個(gè)重要組成部分，同時(shí)對(duì)腸道菌群也有調(diào)節(jié)作用。淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)是淋巴細(xì)胞受抗原或有絲分裂原等刺激活化后及在某些腫瘤、自身免疫病的情況下分泌的一種細(xì)胞因子，分為L(zhǎng)Tα和LTβ兩種亞基。學(xué)者利用LTα-/-的小鼠模型揭示，LTα基因在淋巴組織生成中發(fā)揮了重要作用[1]，T.Shimazu等成功克隆出豬脾的LTβ基因，并初步認(rèn)為L(zhǎng)Tβ基因在初生仔豬的小腸免疫系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮了重要作用[2]，因此分析LTβ基因受體的功能及作用機(jī)制顯得尤為重要。

淋巴毒素β受體(LTβR)，又名腫瘤壞死因子受體超家族成員(TNFRSF3)，是一個(gè)富含半胱氨酸，具有類似腫瘤壞死因子受體結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。LTβR基因在淋巴器官的形成過(guò)程中，如腸系膜淋巴結(jié)的形成及次級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)和功能重建中，起著非常重要的作用[3-4]。研究報(bào)道，LTβR敲除小鼠體內(nèi)血漿和腸道IgA顯著減少，同時(shí)LTβR-/-小鼠缺乏所有的淋巴組織，包括結(jié)腸相關(guān)淋巴結(jié)，脾邊緣區(qū)丟失，B/T細(xì)胞分離以及濾泡樹突狀細(xì)胞缺失等[5]?，F(xiàn)有研究表明，可溶性的淋巴毒素α(s-LTα3)以及膜結(jié)合淋巴毒素β(LTαβ2)可以誘導(dǎo)IgA的生成，從而支持機(jī)體的免疫反應(yīng)。LTβR是腸道IgA產(chǎn)生所必需的，W.Kang等發(fā)現(xiàn)，LTβR信號(hào)通路對(duì)腸道固有層細(xì)胞因子的適度表達(dá)以及對(duì)產(chǎn)生IgA的漿細(xì)胞的歸巢起著重要的作用[6]；此外，H.Guo等[7]利用疾病相關(guān)的eQTL定位結(jié)合貝葉斯定理篩選出6個(gè)免疫疾病調(diào)控相關(guān)基因，其中就包括LTBR基因。以上研究表明，LTβR基因?qū)δc道免疫中IgA調(diào)控以及機(jī)體免疫疾病起關(guān)鍵作用。目前有關(guān)豬LTβR基因的序列、表達(dá)模式以及結(jié)構(gòu)功能等研究相對(duì)較少，本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的豬LTβR基因序列(來(lái)源于電子克隆)進(jìn)行mRNA分子克隆，在此基礎(chǔ)上利用生物信息學(xué)分析豬LTβR蛋白序列特征，構(gòu)建LTβR真核表達(dá)載體并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行LTβR基因的組織表達(dá)譜分析，旨在探討豬LTβR基因的結(jié)構(gòu)與功能，同時(shí)也為下一步細(xì)胞水平上的功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取的8頭35日齡大白斷奶仔豬來(lái)自常州康樂(lè)農(nóng)牧有限公司(國(guó)家生豬核心育種場(chǎng))，屠宰后取11個(gè)組織樣(心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺、淋巴結(jié)、十二指腸和空腸組織)，現(xiàn)場(chǎng)液氮保存，然后轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱備用。采用Trizol法提取總RNA，并利用NanoDrop 1000 Spectrophotometer(NanoDrop Technologies，Inc.，Wilmington，DE，USA)測(cè)定其OD值，并對(duì)OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0的進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.2 生化試劑

質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、切膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)；T4連接酶和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；脂質(zhì)體LipofectaInineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))。DL2000 marker、pMD19-T載體、Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；pEGFP-C1載體購(gòu)自Clontech公司(Canada，Catalog#6084)；JM110感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自深圳市百恩維生物科技有限公司，DH5α感受態(tài)細(xì)胞、HEK293和IPEC-J2小腸上皮細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 目的基因克隆及真核載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中豬LTβR序列(GenBank登錄號(hào)：XM_005653161.1)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物，引物序列為上游：5′-CCTCCCATCTTCCTCCCAGG-3′，下游：5′-GGCTTC-TCCCAGACACCATC-3′，以豬淋巴組織cDNA為模板擴(kuò)增LTβR基因，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 376 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收后，克隆至pMD19-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為DH5α感受態(tài)細(xì)胞，瓊脂平板培養(yǎng)菌落，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。經(jīng)PCR初步鑒定為陽(yáng)性的菌液送往生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序鑒定。

1.4 真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取pMD19-T-LTβR重組質(zhì)粒用xbaⅠ和AccⅠ雙酶切克隆到pEGFP-C1載體，回收目的片段經(jīng)純化回收后，在T4 DNA連接酶作用下4 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM110感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素(100 μg·mL-1)LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆搖菌提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

利用普通質(zhì)粒小抽試劑盒抽提重組質(zhì)粒，豬HEK293和小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2分別在2 mL完全培養(yǎng)液(F12∶DMEM=1∶1，10%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。按照1.0×106個(gè)·孔-1的密度接種于6孔板，培養(yǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。參照脂質(zhì)體LipofectaInineTM2000說(shuō)明書，轉(zhuǎn)染24 h后顯微鏡觀察。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)手段分析LTβR蛋白的基本理化性質(zhì)、基本結(jié)構(gòu)、功能位點(diǎn)和區(qū)域，分別利用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行LTβR蛋白的基本理化性質(zhì)(氨基酸組成、分子量以及等電點(diǎn)等)分析； SignalP4.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行蛋白的信號(hào)肽分析；TMHMM 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行跨膜分析；Anthepro蛋白分析軟件基于Garnier方法進(jìn)行蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；在線軟件NetNGlyc(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析LTβR蛋白糖基化位點(diǎn)；NetPhos(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析潛在磷酸化位點(diǎn)；NetPhosK 1.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/)分析保守的特異性蛋白激酶作用位點(diǎn)；利用PSORTⅡPrediction(http：//psort.hgc.jp/)分析蛋白亞細(xì)胞定位；利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)[8]分析LTβR蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；利用KEGG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析LTβR基因所參與的GO功能和pathway通路。

1.7 豬LTβR基因組織表達(dá)譜檢測(cè)

根據(jù)克隆的豬LTβR和已發(fā)表的GAPDH基因序列[9-10]設(shè)計(jì)熒光定量引物，采用Primer express 2.0 軟件設(shè)計(jì)引物，LTβR基因上游引物：5′-GAAC-CACCTCTCCATCTGCC-3′，下游引物：5′-GTCCCAGAAGACGCAGAACA-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)為133 bp；內(nèi)參GAPDH基因上游引物：5′-ACATCATCCCTGCTTCTACTGG-3′，下游引物：5′-CT-CGGACGCCTGCTTCAC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)為187 bp，所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.4 μL，SYBR Green Real time PCR Master Mix(2×) 10 μL，ddH2O 7.8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 15 s；62 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；4 ℃保存，擴(kuò)增結(jié)束后分析熔解曲線。運(yùn)用熔解曲線上是否具有(85±0.8)℃ Tm峰來(lái)判斷PCR擴(kuò)增的單一性，采用相對(duì)定量的方法計(jì)算每個(gè)組織的表達(dá)水平，相對(duì)定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法[11]進(jìn)行處理，2-ΔΔCt法計(jì)算公式：ΔΔCt =(待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組看家基因平均Ct值)-(對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組看家基因平均Ct 值)，即每一個(gè)組織目標(biāo)基因表達(dá)經(jīng)內(nèi)參均一化處理后相對(duì)于某個(gè)組織的倍數(shù)。每份樣本進(jìn)行3次實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 豬LTβR基因CDS擴(kuò)增及克隆測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得單一目的條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的片段大小(1 376 bp)一致，見圖1A，將克隆產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，該克隆的LTβR基因包含1 209 bp的CDS序列，編碼402個(gè)氨基酸(圖2)；Blast分析顯示，該克隆所包含的大白豬LTβR基因cDNA序列與GenBank提供的預(yù)測(cè)序列同源性達(dá)99.85%，并發(fā)現(xiàn)兩處突變位點(diǎn)，分別為錯(cuò)義突變C422T(A141V)和沉默突變A432G，見圖3。

2.2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

用xbaI 和AccI雙酶切pEGFP-C1-LTβR重組質(zhì)粒及空載體，雙酶切鑒定后測(cè)序，連接正確的即為陽(yáng)性克隆(圖1B)。pEGFP-C1-LTβR重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染豬HEK293和IPEC-J2小腸上皮細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察可見靶細(xì)胞發(fā)出綠色熒光(圖4)，這表明通過(guò)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的LTβR過(guò)表達(dá)片段均可在兩類細(xì)胞中有效表達(dá)，且HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。

A.豬LTβR基因CDS區(qū)擴(kuò)增圖：M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1、2.LTβR基因編碼區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物。B.PEGFP-C1-LTβR重組質(zhì)粒的雙酶切圖：M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL5000；1.重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物；2、3.重組質(zhì)粒PEGFP-C1-LTβR經(jīng)酶切后的產(chǎn)物；4、5.LTβR基因編碼區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物A．The clone CDS result of pig LTβR gene：M.DL2000 marker；1 and 2.The amplification products of LTβR CDS sequence.B.The endonucleases digestion of PEGFP-C1-LTβR：M.DL5000 marker；1.The amplification product of PEGFP-C1-LTβR；2 and 3.The products after endonucleases digestion of PEGFP-C1-LTβR；4 and 5.The amplification products of LTβR CDS sequence圖1 LTβR基因擴(kuò)增產(chǎn)物及雙酶切鑒定Fig.1 PCR products and endonucleases identification of LTβR gene

2.3 豬LTβR蛋白的基本理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，豬LTβR蛋白分子式為C1897H2952N534O586S32，分子質(zhì)量約為43.64 ku，原子總數(shù)為6 001個(gè)，理論等電點(diǎn)pI為5.42，帶正電荷和負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)分別為29和46個(gè)。蛋白質(zhì)中脂肪鏈氨基酸含量表示脂溶指數(shù)(Aliphatic index)，主要由Leu、Ile和Val組成，可以代表蛋白的穩(wěn)定性，本研究發(fā)現(xiàn)LTβR蛋白脂溶指數(shù)為34.59，表明該蛋白是脂溶性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為49.92(>40)，表明該蛋白不穩(wěn)定?？偲骄H水性(GRAVY)為-0.433，表明該蛋白為親水性蛋白。豬LTβR蛋白最大疏水性位于第218位氨基酸，最大親水性位于第29位氨基酸，整體來(lái)看親水性區(qū)域大于疏水性(圖5)；豬LTβR蛋白中205～227位氨基酸之間含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，228～402位氨基酸屬于胞內(nèi)區(qū)，其余的為胞外區(qū)(圖6)；豬LTβR蛋白不存在信號(hào)肽，表明為非分泌蛋白；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α螺旋(Alpha helix)73個(gè)，百分比為18.16%，β延伸鏈(Extended strand)66個(gè)，百分比為16.42%，無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)263個(gè)，百分比為65.42%。

圖2 豬LTβR基因編碼序列及其編碼氨基酸序列Fig.2 The coding sequence and amino acid sequence of pig LTβR

圖3 豬LTβR基因編碼區(qū)SNPs位點(diǎn)篩查Fig.3 Screening of SNP sites in pig LTβR CDS

A、B分別代表了pEGFP-C1-LTβR質(zhì)粒侵染HEK293、IPEC-J2小腸上皮細(xì)胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果；左圖表示熒光視野下的圖片，右圖表示可見光視野下的圖片A，B represent fluorescence microscope observation of HEK293 and IPEC-J2 intestinal epithelial cells infected by pEGFP-C1-LTβR，respectively；left figures represent the photos under the view of fluorescence，right figures represent the photos under the view of visible light圖4 LTβR重組質(zhì)粒侵染HEK293和IPEC-J2小腸上皮細(xì)胞熒光顯微鏡觀察 100×Fig.4 Fluorescence microscope observation of HEK293 and IPEC-J2 intestinal epithelial cells infected by LTβR recombinant plasmid 100×

圖5 豬LTβR蛋白的親/疏水性分析Fig.5 Hydrophilic/hydrophobic analysis of pig LTβR protein

2.4 豬LTβR蛋白的功能分析

在線軟件分析可知，豬LTβR蛋白存在2個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于第21和158位氨基酸(圖7)；該蛋白存在18個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括5個(gè)Ser、9個(gè)Thr和4個(gè)Tyr(圖8)，上述磷酸化位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的磷酸激酶預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在LTβR蛋白上可能有PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10種保守的特異性蛋白激酶的結(jié)合位點(diǎn)(表1)，其中在226位處PKC分值最高為0.90。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，豬LTβR蛋白69.6%可能存在于細(xì)胞核內(nèi)，13.0%可能存在質(zhì)膜上，8.7%可能存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，4.3%可能存在高爾基體內(nèi)，由此進(jìn)一步推測(cè)該蛋白可能為非分泌型蛋白。

圖6 豬LTβR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Transmembrane structure analysis of pig LTβR protein

圖內(nèi)橫線代表閾值；豎線代表潛在糖基化位點(diǎn)；數(shù)字代表氨基酸位置In the figure，abscissa indicate threshold；Vertical line indicate the potential glycosylation sites，number on vertical line indicate the position of amino acids圖7 豬LTβR蛋白的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of glycosylation sites of pig LTβR protein

橫線代表閾值；各條豎線分別代表潛在的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)；絲氨酸位點(diǎn).68、160、161、256、305；蘇氨酸位點(diǎn).47、59、95、98、133、185、190、281、380；酪氨酸.32、69、341、365Abscissa line indicate threshold；Vertical lines indicate potential tyrosine，serine and threonine phosphorylation sites，respectively；Serine sites.68，160，161，256，305；Threonine sites.47，59，95，98，133，185，190，281，380；Tyrosine sites.32，69，341，365圖8 豬LTβR蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of phosphorylation sites of pig LTβR protein

豬LTβR蛋白含有2個(gè)TNFR(Tumor necrosis factor receptor)超級(jí)家族保守結(jié)構(gòu)域，1個(gè)位于32～125位氨基酸，預(yù)測(cè)評(píng)估值E-value為6.16e-28，另一個(gè)位于128～192位氨基酸，預(yù)測(cè)評(píng)估值E-value為1.62e-07，該保守結(jié)構(gòu)域由50’s環(huán)TNF結(jié)合位點(diǎn)(50’s loop TNF binding site)、90’s環(huán)TNF結(jié)合位點(diǎn)(90’s loop TNF binding site)和3個(gè)不同蛋白多肽結(jié)合位點(diǎn)5個(gè)部分組成。KEGG與GO分析發(fā)現(xiàn)，LTβR基因參與分子功能(3個(gè))、細(xì)胞組成(1個(gè))以及生物過(guò)程(8個(gè))等共12項(xiàng)GO功能分類(表2)，同時(shí)還參與細(xì)胞因子受體相關(guān)作用、NF-kappa B信號(hào)通路、IgA 合成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等5項(xiàng)重要的調(diào)控通路(表3)。

表1 豬LTβR保守的特異性蛋白激酶作用位點(diǎn)

Table 1 Conserved and specific phosphkinase binding sites in pig LTβR protein

項(xiàng)目Item絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸Serine/Threonine/Tyrosine激酶KinasePKCCKICKIICDC2DNAPKGSK3CDK5ATMINSRSRC位點(diǎn)Site98、190、2266868、133256689595、161、380305341365

表2LTβR基因參與的GO功能分析

Table 2 GO function analysis ofLTβRgene

GO分類GOclassificationGO編號(hào)GOIDGO具體名稱QualifiedGOterm分子功能MolecularfunctionGO：0005515蛋白結(jié)合ProteinbindingGO：0031625泛素連接酶結(jié)合UbiquitinproteinligasebindingGO：0042802同類蛋白結(jié)合Identicalproteinbinding細(xì)胞組成CellularcomponentGO：0016021完整膜結(jié)構(gòu)Integralcomponentofmembrane生物過(guò)程BiologicalprocessGO：0006915凋亡過(guò)程ApoptoticprocessGO：0007165信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)SignaltransductionGO：0016032病毒過(guò)程ViralprocessGO：0019048病毒形態(tài)或者生理機(jī)能調(diào)節(jié)ModulationbyvirusofhostmorphologyorphysiologyGO：0043123I?kappaB激酶/NF?kappaB信號(hào)的正調(diào)節(jié)PositiveregulationofI?kappaBkinase/NF?kappaBsignalingGO：0046330JNK級(jí)聯(lián)的正調(diào)節(jié)PositiveregulationofJNKcascadeGO：0071260機(jī)械刺激的細(xì)胞反應(yīng)CellularresponsetomechanicalstimulusGO：2001238體外凋亡信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)Positiveregulationofextrinsicapoptoticsignalingpathway

表3LTβR基因參與的Pathway分析

Table 3 Pathway analysis ofLTβRgene

通路編號(hào)PathwayID通路名稱Pathwaytermmap04060細(xì)胞因子受體相互作用Cytokine?cytokinereceptorinteractionmap04064NF?kappaB信號(hào)通路NF?kappaBsignalingpathwaymap04066HIF?1信號(hào)通路HIF?1signalingpathwaymap04672IgA合成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控通路IntestinalimmunenetworkforIgAproductionmap05166HTLV?I感染HTLV?Iinfection

2.5 豬LTβRmRNA組織表達(dá)特異性

所提取組織的總RNA經(jīng)2.2%甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)，無(wú)明顯降解條帶及DNA污染條帶，ND-1000核酸/蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA的A260 nm/ A280 nm為1.8～1.9，說(shuō)明RNA提取質(zhì)量較高可用于后續(xù)試驗(yàn)。組織表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖9)，LTβR基因在肺中表達(dá)水平極顯著高于其他組織(P<0.01)，其次為肝、腎和脾等免疫器官，十二指腸和空腸等腸道組織中也有一定的表達(dá)。

1～11分別表示心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺、淋巴、十二指腸和空腸；不同組織間上標(biāo)包含不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)1-11 represent heart，liver，spleen，lung，kidney，stomach，muscle，thymus，lymphatic，duodenum and jejunum；Superscript between different tissues containing different capital letters mean significant difference (P<0.01)，different small letters mean significant difference(P<0.05)圖9 LTβR在各組織中的表達(dá)分析Fig.9 Expression analysis of LTβR in different tissues

3 討 論

本研究成功克隆得到大白豬LTβR基因全長(zhǎng)CDS區(qū)(長(zhǎng)度為1 209 bp)，共編碼402個(gè)氨基酸，沒有檢測(cè)到不同的可變剪接。與人、小鼠LTβR比對(duì)發(fā)現(xiàn)，氨基酸同源性分別為70.3%和66.9%。LTβR表達(dá)很廣泛，主要表達(dá)在初級(jí)和次級(jí)淋巴樣組織，以及肺、腎等內(nèi)臟器官，外周血沒有表達(dá)。很多貼壁細(xì)胞的原代細(xì)胞系(如HEK293、HT-29、U937等)中都能檢測(cè)到它的表達(dá)，本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體PEGFP-C1-LTβR，并通過(guò)轉(zhuǎn)染熒光檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了LTβR基因在豬HEK293細(xì)胞中具有較高的表達(dá)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)它在豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2中也有表達(dá)。組織表達(dá)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LTβR基因在豬肺、腎以及脾等免疫器官中高表達(dá)，同時(shí)在十二指腸和空腸等腸道組織中也有較高水平的表達(dá)。LTβR能夠分別特異性地結(jié)合LTα和LTβ形成異源三聚體LTα1β2和LIGHT兩種配體，在生物體內(nèi)發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能[12-14]。LTα1β2主要表達(dá)在T淋巴細(xì)胞表面，通過(guò)與間質(zhì)細(xì)胞表面的LTβR結(jié)合，參與次級(jí)淋巴器官和脾的發(fā)育。LTβR與LIGHT結(jié)合可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，在腸系膜淋巴結(jié)的形成以及次級(jí)淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)和功能重建過(guò)程中起著重要作用，并且研究發(fā)現(xiàn)LIGHT是參與調(diào)節(jié)腸道炎癥中不可缺少的物質(zhì)[15]。鑒于LTβR在免疫器官形成和腸道免疫調(diào)控中發(fā)揮的作用，本研究從蛋白功能位點(diǎn)和保守區(qū)域進(jìn)一步分析其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)豬LTβR蛋白存在2個(gè)腫瘤壞死因子受體TNFR超家族保守域，分別位于第32～125和128～192位氨基酸，已有研究發(fā)現(xiàn)，TNFR家族蛋白在不同生物系統(tǒng)中細(xì)胞凋亡或者程序性細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要的作用[16-18]，TNFR區(qū)域作為L(zhǎng)TβR蛋白主要的功能區(qū)域，而本研究發(fā)現(xiàn)了1處突變C422T>A141V位于TNFR功能區(qū)域，可能對(duì)LTβR蛋白功能造成一定的影響，因此C422T突變可能作為今后重點(diǎn)研究LTβR基因作為豬抗病育種的一個(gè)潛在遺傳標(biāo)記。

LTβR基因作為腫瘤壞死因子的家族成員，有關(guān)學(xué)者對(duì)其介導(dǎo)的信號(hào)通路在細(xì)菌微生物感染導(dǎo)致的宿主免疫應(yīng)答中的重要作用做了大量的研究。目前，利用融合蛋白LTβR-IgG體內(nèi)阻斷LTβR介導(dǎo)的信號(hào)通路，是一種常用的研究其生物學(xué)功能的手段[19]。R.Lucas等利用牛分枝菌卡介苗(BCG)感染野生型小鼠和LTβR-IgG處理后的小鼠，發(fā)現(xiàn)LTβR信號(hào)通路的阻斷抑制了處理組小鼠巨噬細(xì)胞的激活和iNOS合成的活性，從而導(dǎo)致小鼠脾的肉芽腫生成數(shù)目減少，這表明LTβR信號(hào)通路在牛分枝菌卡介苗感染中對(duì)Th1型免疫應(yīng)答起著重要的促進(jìn)作用[20]。LTβ-/-小鼠和野生型小鼠分別感染單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，發(fā)現(xiàn)處理小鼠對(duì)細(xì)菌呈現(xiàn)出了顯著的易感性[21]。LTβR介導(dǎo)的信號(hào)通路在大腸桿菌等革蘭陰性菌，嚙齒枸櫞酸桿菌(Citrobacter rodentium)引發(fā)的傳染性結(jié)腸炎中也發(fā)揮了重要作用[22]?？偟膩?lái)說(shuō)，阻斷LTβR介導(dǎo)的信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致宿主在細(xì)菌感染后清除細(xì)菌的免疫機(jī)能受到嚴(yán)重?fù)p壞。此外，LTβR-IgG處理的小鼠對(duì)鼠巨細(xì)胞(MCMV)病毒的易感性增強(qiáng)，導(dǎo)致死亡率增高[23]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，LTβR共參與5個(gè)信號(hào)通路即細(xì)胞因子受體相關(guān)作用、NF-kappa B信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、IgA 合成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控通路和HTLV-I感染。LTβR與LTα1β2和LIGHT結(jié)合后可以激活NF-kappa B信號(hào)通路，并引起腸道淋巴形成等免疫調(diào)控[12-14]，因此，LTβR介導(dǎo)的NF-kappa B信號(hào)通路和IgA 合成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控通路顯得尤為重要。本研究成功構(gòu)建了LTβR基因真核表達(dá)載體，并在豬HEK293和IPEC-J2細(xì)胞中檢測(cè)到其表達(dá)，今后可以進(jìn)一步開展過(guò)表達(dá)以及RNA干擾試驗(yàn)，此外目前最流行的基因定點(diǎn)修飾技術(shù)-CRISPR/Cas9已經(jīng)成功應(yīng)用于細(xì)菌、人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠、豬、食蟹猴以及多種植物的基因組精確修飾[24]，也可以結(jié)合CRISPR/Cas9基因敲除試驗(yàn)從細(xì)胞水平上更加全面地分析LTβR介導(dǎo)的信號(hào)通路在豬抗細(xì)菌感染中的作用機(jī)制，為今后從提高機(jī)體免疫能力的角度來(lái)進(jìn)行分子選育與抗病育種提供指導(dǎo)和依據(jù)。

[1] BANKS T A，ROUSE B T，KERLEY M K，et al.Lymphotoxin-alpha-deficient mice.Effects on secondary lymphoid organ development and humoral immune responsiveness[J].JImmunol，1995，155(4)：1685-1693.

[2] SHIMAZU T，TOHNO M，KATOH S，et al.Utilization of the porcine system to study Lymphotoxin-β regulation in intestinal lymphoid tissue[J].BiochemGenet，2009，47(1-2)：126-136.

[3] LOCKSLEY R M，KILLEEN N，LENARDO M J.The TNF and TNF receptor superfamilies：integrating mammalian biology[J].Cell，2001，104(4)：487-501.

[4] SHAKHOV A N，NEDOSPASOV S A.Expression profiling in knockout mice：lymphotoxin versus tumor necrosis factor in the maintenance of splenic microarchitecture[J].CytokineGrowthFactorRev，2001，12(1)：107-119.

[5] FüTTERER A，MINK K，LUZ A，et al.The lymphotoxin β receptor controls organogenesis and affinity maturation in peripheral lymphoid tissues[J].Immunity，1998，9(1)：59-70.

[6] KANG W，KUDSK K A，SANO Y，et al.Effects of lymphotoxin β receptor blockade on intestinal mucosal immunity[J].JParenterEnteralNutr，2007，31(5)：358-364.

[7] GUO H，F(xiàn)ORTUNE M D，BURREN O S，et al.Integration of disease association and eQTL data using a Bayesian colocalisation approach highlights six candidate causal genes in immune-mediated diseases[J].HumMolGenet，2015，24(12)：3305-3313.

[8] MARCHLER-BAUER A，LU S，ANDERSON J B，et al.CDD：a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins[J].NucleicAcidsRes，2011，39(suppl 1)：D225-D229.

[9] BARBER R D，HARMER D W，COLEMAN R A，et al.GAPDH as a housekeeping gene：analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues[J].PhysiolGenomics，2005，21(3)：389-395.

[10] 吳正常，殷學(xué)梅，夏日煒，等.豬殺菌/通透性增加蛋白基因siRNA載體構(gòu)建及干擾效果評(píng)價(jià)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，46(3)：491-496. WU Z C，YIN X M，XIA R W，et al.Construction and evaluation of porcine bactericidal/permeability-increasing protein gene(BPI) siRNA expression vector[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2015，46(3)：491-496.(in Chinese)

[11] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod[J].Methods，2001，25(4)：402-408.

[12] CROWE P D，VANARSDALE T L，WALTER B N，et al.A lymphotoxin-beta-specific receptor[J].Science，1994， 264(5159)：707-710.

[13] BROWNING J L，DOUGAS I，NGAM-EK A，et al.Characterization of surface lymphotoxin forms.Use of specific monoclonal antibodies and soluble receptors[J].JImmunol，1995， 154(1)：33-46.

[14] MAURI D N，EBNER R，MONTGOMERY R I，et al.LIGHT，a new member of the TNF superfamily，and lymphotoxin alpha are ligands for herpesvirus entry mediator[J].Immunity，1998， 8(1)：21-30.

[15] KRAUSE P，ZAHNER S P，KIM G，et al.The tumor necrosis factor family member TNFSF14(LIGHT) is required for resolution of intestinal inflammation in mice[J].Gastroenterology，2014，146(7)：1752-1762.

[16] BAKER S J，REDDY E P.Transducers of life and death：TNF receptor superfamily and associated proteins[J].Oncogene，1996，12(1)：1-9.

[17] GRUSS H J，DOWER S K.Tumor necrosis factor ligand superfamily：involvement in the pathology of malignant lymphomas[J].Blood，1995，85(12)：3378-3404.

[18] SMITH C A，F(xiàn)ARRAH T，GOODWIN R G.The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins：activation，costimulation，and death[J].Cell，1994，76(6)：959-962.

[19] SPAHN T W，EUGSTER H P，F(xiàn)ONTANA A，et al.Role of lymphotoxin in experimental models of infectious diseases：potential benefits and risks of a therapeutic inhibition of the lymphotoxin-β receptor pathway[J].InfectImmun，2005，73(11)：7077-7088.

[20] LUCAS R，TACCHINI-COTTIER F，GULER R，et al.A role for lymphotoxin β receptor in host defense against Mycobacterium bovis BCG infection[J].EurJImmunol，1999，29(12)：4002-4010

[21] EHLERS S，H?LSCHER C，SCHEU S，et al.The lymphotoxin β receptor is critically involved in controlling infections with the intracellular pathogens Mycobacterium tuberculosis and Listeria monocytogenes[J].JImmunol，2003，170(10)：5210-5218.

[22] SPAHN T W，MAASER C，ECKMANN L，et al.The lymphotoxin-β receptor is critical for control of murineCitrobacterrodentium-induced colitis[J].Gastroenterology，2004，127(5)：1463-1473.

[23] BENEDICT C A，BANKS T A，SENDEROWICZ L，et al.Lymphotoxins and cytomegalovirus cooperatively induce interferon-β，establishing host-virus détente[J].Immunity，2001，15(4)：617-626.

[24] 劉志國(guó).CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因組編輯的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45(10)：1567-1583. LIU Z G.Research progress on CRISPR/Cas9 mediated genome editing[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2014，45(10)：1567-1583.(in Chinese)

(編輯 郭云雁)

Gene Cloning，Prediction of Structure and Function，Analysis of Tissue Expression Profile and Construction of Eukaryotic Expression Vector of PigLTβRGene

WU Zheng-chang1，DAI Chao-hui1，YIN Xue-mei1，SUN Shou-yong1，2，BAO Wen-bin1，2*，WU Sheng-long1，2*

(1.KeyLaboratoryforAnimalGenetics，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.JiangsuEngineeringResearchCenterfortheReproductionandHealthyBreedingofBoar，Yangzhou225009，China)

In order to further explore the biological function of pigLTβRgene，the coding sequence(CDS) ofLTβRgene was amplified from the cDNA of porcine lymphoid tissue and the protein structure and function，GO function，regulatory pathways of porcine LTβR were further analyzed by bioinformatics tools.Real-time PCR was used to detect the expression level of porcineLTβRgene in different tissues of Yorkshire.MeanwhileLTβRgene was cloned into the eukaryotic expression vector pEGFP-C1，then transfected into HEK293 cell and small intestinal epithelial cell IPEC-J2，respectively.The expression of recombinant plasmid was detected in both cells through microscopic observation.The results showed that the pigLTβRcDNA full length was 1 209 bp encoding 402 amino acids.LTβR was a fat-soluble，hydrophilic and unstable protein，containing a transmembrane structure between 205 and 227 amino acids，meanwhile no signal peptide and subcellular localization indicated that LTβR protein was non-secretory.LTβR protein had 2 glycosylation sites，18 potential phosphorylation sites including 10 conservative binding sites of specific protein kinase such as PKC，CKI，CDC2，GSK3，CDK5，INSR，etc.Pig LTβR protein had 2 conservative domains named TNFR superfamily，which were located in the region between 32 and 125 amino acid，between 128 and 192 amino acid，respectively.Besides the mutation C422T>A141V occurred in the conservative domain.KEGG and GO analysis showedLTβRgene participated in 12 GO function classifications，5 regulatory pathways such as NF-kappa B signaling pathway，intestinal immune network for IgA production，etc.Real-time PCR analysis showed the expression level ofLTβRgene in Yorkshire lung tissue was very significantly higher than other tissues(P<0.01).Moreover，LTβRgene was also highly expressed in both pig immune organs such as kidney，spleen and intestinal tissue such as duodenum，jejunum.Transfection experiments and microscopic observation showed the pEGFP-C1-LTβR recombinant plasmid was expressed in both HEK293 and IPEC-J2 cells.This study will provides materials and basis for studying the function ofLTβRgene and LTβR-mediated signaling pathways，therefore it is necessary to further verify and analyze the regulatory mechanism and important role ofLTβRgene and signaling pathways at cellular level，meanwhile we should systematically analyze the mutation C422T as a potential genetic marker for pig disease-resistant breeding.

pig；LTβRgene；cloning；eukaryotic expression vector；structure and function of protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.003

2015-01-07

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2014ZX08006-001B)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31372285；31172183)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)

吳正常(1987-)，男，江蘇南京人，博士生，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：wuzhengchang@126.com

*通信作者：包文斌，研究員，博導(dǎo)，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：wbbao@yzu.edu.cn；吳圣龍，研究員，博導(dǎo)，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：slwu@yzu.edu.cn

S828；S813.3

A

0366-6964(2015)12-2135-11