陳善真，趙 焱，李中圣，羅 均，陳克宏，王貴平，李其昌

(廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400)

含有Th細(xì)胞表位的合成PCV2 ORF2 Cap多肽抗原的表達(dá)及免疫原性分析

陳善真，趙 焱，李中圣，羅 均，陳克宏，王貴平，李其昌*

(廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400)

擬測(cè)定在PCV2 ORF2 Cap P1多肽抗原中添加從PCV2 ORF1、ORF3中篩選的Th細(xì)胞表位多肽在促進(jìn)其免疫原性中的作用，以及合成表達(dá)的PCV2 ORF2 Cap P1多肽抗原作為疫苗抗原的可行性。采用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)方法，篩選獲得1條泛宿主新型Th細(xì)胞表位多肽和3條PCV2特異的含有Th細(xì)胞抗原表位的多肽序列，然后將這4條Th細(xì)胞多肽氨基酸序列與篩選自O(shè)RF2 Cap1上的1條B細(xì)胞表位多肽序列進(jìn)行串聯(lián)組合，密碼子優(yōu)化，插入酶切位點(diǎn)、終止密碼子，然后進(jìn)行密碼子適應(yīng)指數(shù)和分布頻率分析，預(yù)測(cè)可以實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)后再進(jìn)行化學(xué)合成。合成的P1多肽抗原連接到pET-30a表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建表達(dá)工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后P1可實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，SDS-PAGE鑒定表達(dá)量，Western Blot鑒定其生物活性，然后分別免疫小鼠和豬，測(cè)定小鼠免疫后的抗體水平以及豬免疫后P1合成多肽抗原對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的刺激增殖情況。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)合成表達(dá)的PCV2 P1多肽抗原序列，密碼子適應(yīng)性指數(shù)為0.89，能夠?qū)崿F(xiàn)高水平表達(dá)，目的片段大小約為28.29 ku，具有良好的免疫原性；MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，P1多肽抗原免疫后機(jī)體內(nèi)IFN-γ和IL-4的表達(dá)量明顯增加，且與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。這說(shuō)明P1能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，為其作為疫苗用抗原的進(jìn)一步研究奠定了理論基礎(chǔ)。

PCV2；Th細(xì)胞表位多肽；Cap蛋白

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PWMS)的重要病原，感染PCV2的豬可導(dǎo)致淋巴系統(tǒng)損傷和免疫缺陷，這可能是由于PWMS感染后損傷豬的T、B淋巴細(xì)胞，使單核/巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)目增多，并改變細(xì)胞因子的應(yīng)答模式，從而引起機(jī)體抵抗力下降[1-3]。

PCV2能損傷機(jī)體細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答，患有PMWS的豬主要特征為淋巴細(xì)胞缺損和組織細(xì)胞浸潤(rùn)[4]。從PCV2感染和患病豬中分離出來(lái)的外周血單核細(xì)胞，其分泌IFN-γ和記憶性T細(xì)胞的能力下降[5]，而從健康和患PMWS豬中分離到的PBMS用PHA和SEB刺激后，IL-2、IL-4的產(chǎn)量也會(huì)降低[6]。

淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，免疫優(yōu)勢(shì)輔助T細(xì)胞反應(yīng)表位始終定位于ORF1和ORF3 非結(jié)構(gòu)蛋白上[7]。沒(méi)有免疫優(yōu)勢(shì)的線性Th表位定位于ORF2編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白上。這就可以解釋傳統(tǒng)的以PCV2衣殼蛋白為抗原而制備的亞單位疫苗因其Th細(xì)胞表位的稀缺而導(dǎo)致免疫原性的有限性。輔助性T細(xì)胞表位可以誘導(dǎo)保護(hù)性T輔助細(xì)胞(Th)的反應(yīng)，從而發(fā)信號(hào)給B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。因此，以合成肽作為將免疫優(yōu)勢(shì)Th表位呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)是影響合成肽免疫原性一個(gè)關(guān)鍵因素。

Cap蛋白是PCV2 ORF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，免疫動(dòng)物后能產(chǎn)生較好的中和抗體，從而抵御病毒感染對(duì)B細(xì)胞的損傷[8]。豬用疫苗的免疫功能，及其預(yù)防豬感染病毒的能力受多個(gè)病毒的輔助Th細(xì)胞位點(diǎn)的影響，本研究中設(shè)計(jì)的合成肽疫苗，與PCV2衣殼蛋白上篩選定位的B細(xì)胞表位相比，除具有免疫優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位外，還增加了通用型和PCV2特異的Th細(xì)胞表位，輔助Th細(xì)胞位點(diǎn)與Cap蛋白B 細(xì)胞位點(diǎn)的交叉保護(hù)可大大提高疫苗的效力。

鑒于疫苗對(duì)防制此病的意義[9]，本研究選取ORF2的主要B細(xì)胞抗原表位，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)增加泛宿主新型輔助T細(xì)胞表位多肽序列，組合后進(jìn)行密碼子優(yōu)化，增加其抗原性及表達(dá)量，然后借助大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其表達(dá)，并通過(guò)小鼠和斷奶仔豬的免疫試驗(yàn)，檢測(cè)抗體水平和刺激淋巴細(xì)胞增殖的情況來(lái)測(cè)定合成表達(dá)的PCV2合成肽抗原的免疫原性，為下一步的疫苗相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞、蛋白質(zhì)Marker，預(yù)染Marker，購(gòu)自TIANGEN生物；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ，購(gòu)自TaRaKa生物；IPTG、卡那霉素、肝素鈉、淋巴細(xì)胞分離液、MTT、Gibco RPMI-1640培養(yǎng)液及其他常規(guī)試劑、培養(yǎng)基購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；ISA201VG佐劑，由SEPPIC公司提供；勃林格PCV2商品苗，氨基酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

BALB/c小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，試驗(yàn)用斷奶仔豬，12頭，購(gòu)于鶴山市某豬場(chǎng)，均未進(jìn)行PCV2疫苗免疫，隨機(jī)分為4組，每組3頭：P1抗原免疫組、勃林格疫苗免疫組、空白佐劑免疫組和空白對(duì)照組。

1.3 重組多肽序列P1的設(shè)計(jì)

參考相關(guān)的研究[7，10]，設(shè)計(jì)篩選并合成含有泛宿主新型輔助T細(xì)胞表位的4條多肽，篩選部位來(lái)自于PCV2 ORF1、ORF3，并參考其他學(xué)者的研究[11-12]從PCV2 ORF2中篩選出1條主要的B細(xì)胞多肽抗原表位，然后利用連接性堿基將這5條多肽進(jìn)行串聯(lián)，增加相應(yīng)的連接性氨基酸及酶切位點(diǎn)，對(duì)其中的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定密碼子適應(yīng)指數(shù)及密碼子選擇頻率。將優(yōu)化設(shè)計(jì)完成的氨基酸序列命名為P1，P1序列含有256個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為28.29 ku。

1.4 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

表達(dá)序列設(shè)計(jì)完成后送由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成，并將序列經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，連接到pET-30a表達(dá)載體中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建完成的表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-30a-P1。

1.5 P1的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建完成的表達(dá)質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建表達(dá)工程菌BL21(DE3) pLysS-pET-30a-P1。挑取單個(gè)菌落在含有0.05%卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)，待OD600 nm值達(dá)到0.6 時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使其終濃度為1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)表達(dá)6 h后收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.6 P1免疫原性的Western Blot分析

應(yīng)用Western Blot驗(yàn)證表達(dá)多肽P1的免疫原性，方法如下：①以表達(dá)的P1為樣品，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；②轉(zhuǎn)膜，封閉；③以自制純化的PCV2豬多克隆抗體為一抗，1∶500倍稀釋后進(jìn)行孵育(37 ℃，1 h)，清洗；④加1 000倍稀釋的HRP-羊抗豬IgG二抗，孵育(37 ℃ 1 h)，清洗；⑤應(yīng)用DAB 顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.7 小鼠免疫試驗(yàn)驗(yàn)證P1免疫原性

將表達(dá)純化的P1按照5 μg·mL-1的濃度分別免疫8～10 g的BALB/c小鼠，一免兩周后進(jìn)行采血并二免，二免劑量同第一次免疫劑量。分別在免疫前、一免后2周、二免后2、3、5周采血，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血清抗體水平，驗(yàn)證P1的免疫原性。

1.8 MTT試驗(yàn)測(cè)定P1合成表達(dá)多肽對(duì)外周淋巴細(xì)胞的增殖刺激作用

將P1與ISA 201VG佐劑按說(shuō)明書(shū)比例混勻后，免疫斷奶仔豬，2 mL·頭-1，佐劑組僅免疫佐劑，2 mL·頭-1，勃林格疫苗免疫組，1 mL·頭-1，空白對(duì)照組免疫滅菌生理鹽水，2 mL·頭-1。免疫5周后分別無(wú)菌采集4個(gè)組的頸靜脈外周抗凝血，10 mL·頭-1，收集豬血清后，超凈臺(tái)內(nèi)分離淋巴細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(>95%)，然后用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106mL-1，制成單細(xì)胞懸液。

將淋巴細(xì)胞懸液加入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入PCV2 P1表達(dá)多肽純化抗原10 μL(終質(zhì)量濃度為10 μg·孔-1)，每個(gè)樣品平行培養(yǎng)三孔，同時(shí)用其他組作為對(duì)照，培養(yǎng)體系為每孔1 mL。置5% CO2，37 ℃培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔取500 μL細(xì)胞上清液，-20 ℃保存待檢，余下每孔加入25 μL MTT(初始質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔吹打混勻，然后每孔取出200 μL依次加入96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)板中再依次加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩 10 min，待結(jié)晶物充分溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)各孔的OD值(570 nm處)。

1.9 MTT試驗(yàn)中T細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-4的檢測(cè)

取上述MTT試驗(yàn)中，37 ℃培養(yǎng)44 h取樣的細(xì)胞上清液，分別用IFN-γ和IL-4的試劑盒檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞中兩種細(xì)胞因子的含量，比較不同試驗(yàn)組細(xì)胞上清液中IFN-γ和IL-4的分泌表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 P1多肽序列的篩選及優(yōu)化

將篩選的1條含有泛宿主新型Th細(xì)胞表位多肽和從PCV2 ORF1、ORF3中篩選的3條Th細(xì)胞表位多肽(圖1)與從ORF2中篩選的1條含有多個(gè)B細(xì)胞抗原表位的多肽序列(圖2)，通過(guò)銜接性密碼子進(jìn)行串聯(lián)，設(shè)計(jì)插入酶切位點(diǎn)和起始終止密碼子，并對(duì)組成的堿基序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化完成的含有Th細(xì)胞表位、B細(xì)胞表位以及酶切位點(diǎn)的P1氨基酸序列見(jiàn)圖3。優(yōu)化完成的堿基序列大小為768 bp，預(yù)測(cè)可表達(dá)256個(gè)氨基酸。

2.2 優(yōu)化重組后P1多肽序列的密碼子適應(yīng)指數(shù)分析

作者將序列設(shè)計(jì)優(yōu)化完成后對(duì)氨基酸序列的密碼子偏好性進(jìn)行了分析。密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index，CAI)，常用于基因表達(dá)水平的測(cè)量。此值為0～1，越接近1表示基因的表達(dá)水平越高，當(dāng)密碼子適應(yīng)指數(shù)為1.0時(shí)，生物體基因可以達(dá)到最佳的表達(dá)水平。圖4結(jié)果表明密碼子適應(yīng)性指數(shù)為0.89，說(shuō)明重組優(yōu)化的基因序列可以實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)。

圖1 從PCV2 ORF1、ORF3中篩選的含有輔助T細(xì)胞表位的多肽序列Fig.1 Screening peptide sequences of helper T cell epitopes derived from PCV2 ORF1 and ORF3

圖2 ORF2中篩選的含有多個(gè)B細(xì)胞表位的多肽序列(47-200 aa)Fig.2 Peptide sequences of B cell epitopes derived from PCV2 ORF2(47-200 aa)

圖3 優(yōu)化完成的重組多肽PCV2 P1氨基酸序列(包含酶切位點(diǎn)和終止密碼子)Fig.3 The optimized amino acid sequence of the recombinant peptide P1 containing restriction enzyme cutting site and terminator codon

圖4 基因序列長(zhǎng)度中的密碼子利用頻率分布(CAI，密碼子適應(yīng)指數(shù))Fig.4 The distribution of codon usage frequency along the length of the gene sequence

2.3 優(yōu)化重組序列的密碼子選擇頻率分析

最優(yōu)密碼子是指在某物種高表達(dá)基因中使用頻率最高的密碼子，最優(yōu)密碼子使用頻率(frequency of optimal codons，F(xiàn)OP)可以反映一段基因序列中密碼子在表達(dá)過(guò)程中的利用情況。由圖5可見(jiàn)，橫坐標(biāo)中數(shù)值100是指在一個(gè)設(shè)定的氨基酸序列中密碼子在希望的機(jī)體或組織表達(dá)過(guò)程中的利用頻率的最高值。而作者設(shè)計(jì)優(yōu)化的序列經(jīng)最優(yōu)密碼子使用頻率分析發(fā)現(xiàn)，有71%的密碼子利用頻率在91%～100%，這說(shuō)明作者優(yōu)化設(shè)計(jì)的序列可以實(shí)現(xiàn)高水平的表達(dá)。

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將重組后的表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖電泳(圖6)鑒定發(fā)現(xiàn)，目的片段長(zhǎng)度與768 bp的理論值相符。

2.5 P1表達(dá)后SDS-PAGE鑒定

將構(gòu)建表達(dá)工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1培養(yǎng)后，用終濃度為1.0 mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)6 h后收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。由鑒定結(jié)果圖7可見(jiàn)，誘導(dǎo)后有兩條蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)，其中一條為大腸桿菌的本底表達(dá)，另一條為目的條帶，大小約為28.29 ku，且目的條帶表達(dá)量高于大腸桿菌的本底表達(dá)。

圖5 計(jì)算機(jī)推算的最優(yōu)密碼子的分布頻率(FOP)Fig.5 The percentage distribution of codons in computed codon quality groups

1.重組表達(dá)質(zhì)粒；2.酶切后質(zhì)粒；M.1 kb DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.5004538-1 plasmid；2.5004538-1 plasmid digested；M.1 kb ladder圖6 重組表達(dá)質(zhì)粒的NdeⅠ、XhoⅠ酶切鑒定Fig.6 Identification of recombined PCV2-P1 by double enzyme digestion with NdeⅠ and XhoⅠ

2.6 P1免疫原性的Western Blot分析

將誘導(dǎo)表達(dá)的P1多肽抗原進(jìn)行Western Blot分析，以自制純化的PCV2豬高免血清抗體為一抗進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的重組多肽抗原可以與PCV2的高免豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖8)，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物的抗原性良好。

2.7 小鼠免疫P1多肽抗原后抗體水平檢測(cè)

將表達(dá)純化的P1多肽抗原按1 μg·mL-1包被酶標(biāo)板，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h，4 ℃過(guò)夜。次日洗滌3次，每次250 μL·孔-1洗滌液，然后加封閉液150 μL·孔-1，37 ℃封閉孵育1 h，同上方法洗滌后，分別對(duì)小鼠在免疫前、一免后2周、二免后2、3、5周的血清進(jìn)行檢測(cè)，由圖9結(jié)果可見(jiàn)，免疫后抗體隨免疫時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明P1多肽抗原可以引起小鼠機(jī)體的免疫反應(yīng)。2.8 MTT試驗(yàn)測(cè)定P1對(duì)外周淋巴細(xì)胞的增值刺激

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3.誘導(dǎo)6 h后樣品；2.誘導(dǎo)4 h后樣品； 4.誘導(dǎo)前樣品M.Protein marker；1，3.Sample after 6 hours’ induction；2.Sample after 4 hours’ induction；4.Sample before induction圖7 重組 P1多肽抗原表達(dá)后SDS-PAGE鑒定Fig.7 Identification of the expression of recombinant peptide antigen P1 by SDS-PAGE

M．蛋白質(zhì)預(yù)染相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物M．Prestained protein marker；1.Expression product after induction圖8 重組 P1多肽抗原表達(dá)后Western Blot分析Fig.8 Western Blot analysis of the expressed recombinant peptide antigen P1

分別用表達(dá)純化的P1多肽抗原對(duì)P1疫苗免疫組、空白對(duì)照組進(jìn)行刺激，并設(shè)勃林格疫苗免疫組、佐劑免疫組和空白對(duì)照無(wú)刺激組作為對(duì)照，檢測(cè)P1對(duì)豬外周血中淋巴細(xì)胞的刺激作用。在免疫65 d后采集外周血，每個(gè)樣品平行檢測(cè)3次，具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。另，刺激指數(shù)SI(stimulation index)也可作為判斷淋巴細(xì)胞增殖滴度的一個(gè)重要指標(biāo)。用表達(dá)純化的P1多肽抗原刺激P1多肽抗原免疫組和空白對(duì)照組，并分別設(shè)無(wú)刺激對(duì)照，對(duì)SI值進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖9 P1免疫小鼠后抗體水平檢測(cè)Fig.9 The antibody level detection of polypeptide antigen P1 in immunized mice

表1 不同免疫組表達(dá)多肽P1刺激后淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 The results of lymphocyte proliferation stimulated by peptide P1 to different immunity group

組別Group免疫時(shí)間/dImmunizationday樣品數(shù)SamplesOD值ODvalueA、P1免疫+P1刺激P1immunity+P1stimulation6531．2007±0．0119aB、勃林格疫苗免疫+無(wú)刺激Boehringervaccineimmunity+nostimulation6530．4123±0．1877cC、空白對(duì)照組+P1刺激Black+P1stimulation6530．6780±0．0361bD、佐劑免疫組+無(wú)刺激Adjuvantimmunity+nostimulation6530．3460±0．0656dE、空白對(duì)照組+無(wú)刺激Black+nostimulation6530．3407±0．0674d

同列數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下表同

Different letters in the same row means significant difference between the treatments(P<0.05)，same letter in the same row means not significant difference between treatments(P>0.05).The same as below

由表1結(jié)果可見(jiàn)，A、B、C組與其他各處理試驗(yàn)組之間差異均顯著(P<0.05)，D組與E組差異不顯著(P>0.05)，這說(shuō)明佐劑免疫組與空白對(duì)照組無(wú)差別，經(jīng)表達(dá)多肽P1刺激后A、C組的淋巴細(xì)胞增值情況較B、D、E組均有顯著性差異(P<0.05)，這說(shuō)明P1多肽可以有效刺激機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞的增殖；A、C組的差異可以看出同樣經(jīng)P1多肽刺激后，P1多肽免疫組比空白對(duì)照組的淋巴細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，說(shuō)明P1多肽疫苗有較好的刺激機(jī)體產(chǎn)生T細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。

淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)：即試驗(yàn)孔的OD值/對(duì)照孔的OD值，可作為反應(yīng)抗原對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激作用。由圖10結(jié)果可見(jiàn)，P1多肽對(duì)空白組豬血清中淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)大于2.0，對(duì)P1多肽抗原免疫組的刺激指數(shù)在3.0以上，說(shuō)明P1可以有效刺激豬體外周血淋巴細(xì)胞的增殖，即可以刺激豬體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

2.9 T細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-4的檢測(cè)

IFN-γ、IL-4的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

IFN-γ是由T淋巴細(xì)胞中的Th1細(xì)胞分泌的，可以參與細(xì)胞的免疫應(yīng)答，因此其含量的檢測(cè)可以反應(yīng)機(jī)體受到抗原刺激后，細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平。多肽P1免疫后的豬外周血液樣本再用P1多肽刺激后，IFN-γ含量(表2)與其他試驗(yàn)組和空白對(duì)照組相比有明顯升高，且差異顯著(P<0.05)，多肽P1免疫組與勃林格疫苗免疫組IFN-γ的產(chǎn)生水平均高于佐劑對(duì)照和空白對(duì)照組，這說(shuō)明疫苗免疫后會(huì)刺激豬體內(nèi)IFN-γ的表達(dá)，而PCV2 P1多肽免疫后，豬體內(nèi)IFN-γ的表達(dá)量明顯增加，這可能是由于P1多肽序列中既包含有B細(xì)胞抗原表位，又含有輔助Th細(xì)胞表位，從而可以更好地激活機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，抵抗PCV2病毒的入侵。

圖10 P1重組多肽抗原刺激對(duì)淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)的影響Fig.10 The effect of P1 recombinant peptide antigen stimulating to lymphocyte stimulation index(SI)

表2 T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4的檢測(cè)

Table 2 The level of IFN-γ、IL-4 secreted by T cell

組別Group平行數(shù)Parallelnumber平均質(zhì)量濃度/(pg·mL-1)AverageconcentrationIFN?γIL?4多肽P1免疫+P1多肽刺激P1immunity+P1stimulation370．4108±1．1221a17．4993±0．7152a多肽P1免疫+不刺激P1immunity+nostimulation327．8327±0．4015c12．1113±0．6794b空白對(duì)照組+P1多肽刺激Black+P1stimulation349．6751±1．2854b11．5897±0．5941b勃林格疫苗免疫+不刺激Boehringervaccineimmunity+nostimulation328．0214±0．5349c9．5663±0．1723c佐劑免疫對(duì)照組+不刺激Adjuvantimmunity+nostimulation37．4554±0．5072d7．3393±0．3243d空白對(duì)照組+不刺激Black+nostimulation36．8706±0．1634d6．7923±0．1009d

IL-4是由Th2細(xì)胞分泌的，其對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答有重要的作用，可以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，因此，其含量的高低可影響機(jī)體的體液免疫應(yīng)答的能力。由表2結(jié)果可見(jiàn)，多肽P1免疫組和勃林格疫苗免疫組與空白對(duì)照和佐劑對(duì)照組差異均顯著(P<0.05)，這說(shuō)明兩種疫苗免疫后均可使機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞分泌IL-4的量大大提高；多肽P1免疫+P1刺激組 IL-4的產(chǎn)生水平高于單獨(dú)疫苗免疫組，同時(shí)空白對(duì)照組在用P1多肽刺激后T細(xì)胞分泌IL-4的能力也明顯高于空白對(duì)照組，且均差異顯著(P<0.05)，這說(shuō)明合成表達(dá)的P1多肽與傳統(tǒng)疫苗相比，其刺激分泌表達(dá)IL-4的量明顯增加，可間接的刺激機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，這正是由于其序列中包含的Th細(xì)胞表位多肽發(fā)揮的作用。

3 討 論

PCV2感染后容易導(dǎo)致免疫抑制，從而引發(fā)多重感染和復(fù)發(fā)感染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，PCV2感染所導(dǎo)致的免疫抑制可能是由于Th細(xì)胞受到抑制而造成的，有研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染豬的胸腺和扁桃體中的IL-10和IFN-γ mRNA的量均有所增加，而淋巴細(xì)胞中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA水平則有所下降[6]，這些細(xì)胞因子含量的異常變化表明PCV2可以導(dǎo)致T細(xì)胞免疫抑制。臨床預(yù)防中主要是采用滅活疫苗和亞單位疫苗免疫。PCV2滅活疫苗存在免疫持續(xù)時(shí)間短及病毒培養(yǎng)時(shí)滴度難以提高而使免疫成本較高的問(wèn)題，而亞單位疫苗由于Th表位基因的稀缺而存在不能有效激活機(jī)體的免疫反應(yīng)的缺點(diǎn)，因此近年來(lái)的研究多傾向于尋找一種有效地可以增強(qiáng)疫苗免疫效果的佐劑或是研發(fā)新的表位抗原肽疫苗。

吳勝昔等以固相合成法將3個(gè)B細(xì)胞抗原表位和1個(gè)通用型Th細(xì)胞表位串連在一起，利用設(shè)計(jì)合成的豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白新型表位抗原肽免疫小鼠，病毒中和試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，該抗體具有較好的免疫保護(hù)作用[13]，但該研究中并未進(jìn)一步測(cè)定合成的多肽對(duì)機(jī)體免疫刺激的影響。本研究中在設(shè)計(jì)合成的基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)小鼠和豬的免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了合成表達(dá)的PCV2 Cap P1多肽在刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫方面的作用，并選擇代表性的IFN-γ和IL-4的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明外源Th細(xì)胞表位多肽的加入可以刺激機(jī)體內(nèi)該類細(xì)胞因子的表達(dá)，使其產(chǎn)量明顯高于機(jī)體正常的表達(dá)量，從而可以緩解PCV2感染而造成的Th細(xì)胞免疫抑制。

IFN-γ是一種由活化的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，它不僅可以提高CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞的靶細(xì)胞的能力，也可以誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-2受體，L.Genmei等的研究表明，IFN-γ可以顯著增強(qiáng)PCV2疫苗的免疫原性[14]。IL-4是由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有重要的免疫作用，可以促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞的相互作用，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，從而促進(jìn)體液免疫應(yīng)答[6]。F.Gao等的研究表明，PCV2感染后會(huì)引起豬體內(nèi)IL-4含量的降低[15]，因此，在包含刺激這些細(xì)胞因子的多肽序列的存在可以明顯提高疫苗的保護(hù)力，本研究的試驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。

4 結(jié) 論

一種多肽亞單位抗原其免疫原性的強(qiáng)化，可以通過(guò)共價(jià)鍵耦聯(lián)到有針對(duì)性的B細(xì)胞表位，即在B細(xì)胞表位基礎(chǔ)上針對(duì)的增加外源而多樣的Th細(xì)胞表位。本研究在前人研究基礎(chǔ)上選取PCV2 Cap蛋白的主要B細(xì)胞多肽表位，同時(shí)設(shè)計(jì)加入了4條Th細(xì)胞表位多肽，合成表達(dá)的PCV2 P1多肽抗原組裝成疫苗，疫苗進(jìn)入機(jī)體后可以有效地激活機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，從而大大提高了疫苗的保護(hù)力，為后續(xù)其作為疫苗抗原的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為其他疫病多肽疫苗的研究提供了思路。

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(編輯 白永平)

Expression and Immunogenicity Analysis of PCV2 Cap Recombinant Protein Antigen which Contains Helper T cell Epitope Peptides

CHEN Shan-zhen，ZHAO Yan，LI Zhong-sheng，LUO Jun，CHEN Ke-hong，WANG Gui-ping，LI Qi-chang*

(GuangdongHaidInstituteofAnimalHusbandry&Veterinary，Guangzhou511400，China)

To determine the role of Th cell epitopes，which were screened from PCV2 ORF1，and ORF3，in improving the PCV2 ORF2 Cap P1 immunogenicity when they were added to the sequence，and the feasibility of synthetic expression of PCV2 ORF2 Cap P1 as a vaccine antigen，bioinformatics and molecular biology methods were employed to screen the peptide sequences.A pan-host of T helper cell epitope peptides and three Th cell epitopes peptide sequences of PCV2-specific were identified.These 4 Th cells peptides sequences were combined with a B-cell epitope peptide sequence screened from PCV2 ORF2 Cap1 gene，and then codon was optimized and inserted the restriction sites and stop codons.After analyzing the codon adaptation index and the frequency distribution，predicted it can achieve efficient expression，further chemical synthesis or peptides were carried out.The synthetic polypeptide antigen P1 was connected to the pET-30a expression vector，and transformed into BL21(DE3) pLysS competent cells，the expression in the engineered bacteria BL21(DE3) pLysS-pET-30a-P1 was constructed.The P1 antigen was able to be expressed after IPTG inducting.The expression level was identified by SDS-PAGE，and its biological activity was identified by Western Blot，followed by mice and pigs immunization with P1.Antibody levels in mice and the peripheral blood lymphocyte proliferation in pigs were tested.The results showed that the codon adaptation index of PCV2 P1 sequence was 0.89，it can achieve to high levels of expression，and the peptide fragment is about 28.29 kDa.MTT results showed that P1 peptide antigen had good immunogenicity.In immunized pigs，the expression of IFN-γ and IL-4 can increase obviously，and were significantly different to the control group(P<0.05).These results indicated that P1 could induce a strong humoral and celluar immune response，and it will provide a theoretical basis on PCV2 P1 peptide antigen as a vaccine antigen for further studies.

PCV2；helper T cell epitope peptides；Cap protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.020

2015-03-31

廣東省科技計(jì)劃星火計(jì)劃項(xiàng)目(2012A020603026)

陳善真(1984-)，女，山東安丘人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物疫病診斷及疫苗相關(guān)研究，E-mail：chensz2@haid.com.cn

*通信作者：李其昌，博士，E-mail：liqc2@haid.com.cn

S852.4

A

0366-6964(2015)12-2273-09