劉雪雪，阿地力江·卡德爾，董坤哲，王月月，潘建飛，浦亞斌，何曉紅，馬月輝，蔣 琳*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

德保矮馬X染色體選擇信號篩選

劉雪雪1，阿地力江·卡德爾1，董坤哲1，王月月1，潘建飛2，浦亞斌1，何曉紅1，馬月輝1，蔣 琳1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

旨在對德保矮馬(Debao pony)X染色體的選擇信號進行篩選。本研究利用Illumina公司開發(fā)的馬芯片Equine 65K SNP BeadChip，對德保矮馬、伊犁馬、蒙古馬進行X染色體掃描，獲得2 339個SNPs位點。通過群體分化系數(shù)FST法和XP-EHH兩種不同的方法，分別以伊犁馬和蒙古馬為對照群體對德保矮馬進行X染色體選擇信號檢測。結果，篩選到兩個受到較強選擇區(qū)域4.0～39.9和87.1～123.5 Mb，包含64個“離群位點”。通過基因注釋篩選到PHEX、BCOR、PNPLA4和GPC3等與生長和骨骼發(fā)育相關的基因。研究結果發(fā)現(xiàn)，德保矮馬的選育過程中X染色體很多與生長相關的基因受到了強烈的選擇，其中部分在馬中未見報道，可以作為研究矮小性狀的重要候選基因。

德保矮馬；FST；XP-EHH；X染色體；選擇信號

動物的生長發(fā)育調(diào)控機制以及人和動物的矮小機理一直是國內(nèi)外的研究熱點。目前，對小型馬的矮小特性的研究報道較少，機理尚不清楚，而且大多數(shù)前期研究都集中在常染色體，性染色體相關的研究很少。德保矮馬是體高在100 cm以下的小型地方品種資源[1]。在德保矮馬的培育過程中，許多重要的性狀受到過高強度的人工選擇，長期的人工選擇使得德保矮馬的形態(tài)特征得到很大的變化，尤其是能夠適應山區(qū)的矮小體格。當對16種馬的身高分析時發(fā)現(xiàn)，轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β) 通路的ANKRD1基因上調(diào)導致肌肉萎縮和骨質(zhì)流失[2]，另有研究表明，胰島素樣生長因子IGF1對成年馬的身高有決定性的作用[3]。隨著高通量測序技術的普及，對馬的全基因組測序篩選與選擇相關的位點已經(jīng)成為一種可靠的方法。當用GWAS(Genome-wide association study) 技術對65個品種的1 215匹馬進行分析時發(fā)現(xiàn)，3、6、9和11號染色體上的4個位點能夠解釋身高83%的變異[2]。其中3號和9號染色體上的位點附近有LCORL(Ligand-dependent nuclear receptor compressor like protein)/NCAPG(Non-SMC condensing I complex subunit) 和ZFAT(Zinc finger and AT hook domain containing)[3]與生長相關的基因。對牛的身高研究中也發(fā)現(xiàn)了LCORL/NCAPG[4]。

2005年《Nature》上的一篇文章報道，X染色體是3億年前由常染色體進化而來，進化過程中很多原始的有功能的保守區(qū)域被保留下來[5]，揭示了X染色體在進化過程中的重要功能。而X染色體的確含有很多影響生長的基因。NCBI(The National Center for Biotechnology Information) 數(shù)據(jù)庫顯示，馬的X染色體長124 Mb，約占馬整個基因組的4.6%，攜帶了大量與生長和繁殖相關的基因，其中包括參與創(chuàng)傷的愈合和組織再生的FGF家族成員、與骨組織發(fā)育相關的SOX家族成員以及AR(雄激素受體基因)、TBG(甲狀腺結合球蛋白基因)、ACSL長鏈?；o酶A合成酶基因等。這些數(shù)據(jù)顯示了X染色體在生長發(fā)育進化過程中有著十分重要的作用。近幾年選擇信號篩選已經(jīng)成為研究表型變異的重要方法，也為研究X染色體受選擇的位點或區(qū)域提供了途徑。不同的品種在人為選育過程中，對目標基因的定向選擇使得其在群體中的優(yōu)勢等位基因頻率增加，通常表現(xiàn)為染色體長度范圍的連鎖不平衡或者遺傳多態(tài)性的降低。

本研究綜合固定指數(shù)FST和XP-EHH(Cross Population Extended Haplotype Homozygosity) 的方法，分別以伊犁馬和蒙古馬為對照對德保矮馬進行X染色體選擇信號篩選，旨在揭示德保矮馬由于選擇造成的基因組印記，同時應用生物信息學方法尋找到選擇信號所在區(qū)域覆蓋的基因。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗對象是德保矮馬(20匹，以下簡稱DB)、伊犁馬(26匹，以下簡稱YL)和蒙古馬(16匹，以下簡稱MG)3個馬品種的母馬，分別來自廣西德?？h、新疆昭蘇縣、內(nèi)蒙古呼倫貝爾盟以及內(nèi)蒙古錫林郭勒盟。德保矮馬的平均身高為97.42 cm，伊犁馬和蒙古馬分別為147.04和134.07 cm。所有馬匹隨機選取并且無系譜信息。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因分型與質(zhì)量控制 用Pro-Mega(Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit，Promega)試劑盒提取血液全基因組DNA，使用AstraGene AstraNet紫外分光光度計測定其濃度和純度。合格的DNA濃度應大于50 ng·μL-1，純度OD260 nm/OD280 nm應為1.6～2.0，OD260 nm/OD230 nm為1.8～2.1。每個樣品測3次取平均值，合格的樣品放于-20 ℃冰箱中備用。提取全基因組DNA后，用Illumina Equine 65K SNP BeadChip芯片進行基因型測定。對得到的62匹母馬個體的X染色體3 409個SNPs位點，用Plink[6]軟件進行質(zhì)量控制。質(zhì)控標準個體檢出率(Call rate)>0.9，SNP檢出率>0.9，群體間最小等位基因頻率(MAF)>0.05，哈溫不平衡檢驗(Hardy-Weinberg equilibrium)P值>10-5，最后得到59個個體(德保19個，伊犁26個，蒙古14個)，2 334(68.5%)個SNPs位點供下一步分析。X染色體長度約124 Mb，平均位點相距36.4 kb。

1.2.2 主成分分析 為了解群體間的聚類情況，以及群體的分層，進行了PCA(Principal component analysis)主成分分析[7]，首先用Plink軟件對2 334個SNPs位點的基因型進行二進制的轉換，再用R語言的SNPRelate[8]包計算并繪圖。本研究選取Pairwise LD(r2)>0.2的位點來避免連鎖不平衡對群體分層結果的影響[9]。

1.2.3 選擇信號檢測 群體間選擇信號的檢測能反映不同群體經(jīng)歷不同的育種目標和進化歷史。本試驗采用兩種檢測選擇信號的方法，基于群體分化指數(shù)FST、基于連鎖不平衡(LD)和單倍型XP-EHH兩種方法，兩種方案能有效排除干擾因素，找到真正的選擇信號。

FST是檢測群體間分化程度的重要指標之一，而對于全基因組范圍內(nèi)單個位點估算FST值就能對每個位點分析其分化程度，最終實現(xiàn)選擇信號檢測。本試驗參考B.S.Weri等[10]無偏估計理論，用Genepop4.2[11]軟件計算DB-MG和DB-YL對之間的SNP的FST值。并計算每個位點的經(jīng)驗P值，并將PE<0.05的位點作為“候選位點”。

XP-EHH分析 位于經(jīng)驗FST分布尾端的位點被認為是“離群位點”[12]，該方法沒有選擇方向性，會對試驗結果的可靠性產(chǎn)生疑問，并且由于基因搭乘，所以選擇信號位點的另一個特征是“長范圍的連鎖不平衡”。以單倍型為基礎的群體間擴展單倍型純合度(Cross population extended haplotype homozygosity，XP-EHH)[13]，該方法是一種基于單倍型思想并通過群體間(試驗群體-對照群體)比較策略檢測不同群體(品種)間選擇信號的方法，對那些將要或者已經(jīng)固定的受選擇位點具有極高的檢測效力。本試驗計算DB-MG和DB-YL品種對之間的XP-EHH，并將P<0.05的位點視為“候選位點”。1.2.4 生物信息學分析 兩種方法都篩選到的“候選位點”為本試驗的“離群位點”，位點上下200 k的區(qū)域為候選區(qū)域，然后利用馬(Equuscaballus[14])的基因組信息和BioMart[15]軟件(http：//asia.ensembl.org/biomart/martview/)對候選區(qū)域進行注釋，以及對注釋基因進行分析。

2 結 果

2.1 主成分分析

對3個品種的馬進行主成分分析，結果見圖1，PCA1解釋了3.26%的變異，PCA2解釋了2.47%的變異，發(fā)現(xiàn)3個群體沒有交互的現(xiàn)象，說明3個群體血緣關系較遠，沒有雜交的現(xiàn)象，與地理距離相符，并且沒有離群的個體。為后續(xù)的FST和XP-EHH奠定了基礎。

圖1 3個馬品種主成分分析Fig.1 PCA analysis of 3 horse breeds

2.2 選擇信號檢測

2.2.1FST結果 本研究對質(zhì)控后的2 334個SNPs位點，用Genepop4.2軟件計算兩兩群體之間每個位點的遺傳分化系數(shù)FST值，并計算經(jīng)驗P值。DB-MG有2 257個SNPs位點計算FST值，DB-YL是2 137個，其分布如圖2所示，有很多位點位于FST分布尾端(FST>0.2)，表明伊犁馬和蒙古馬與德保矮馬之間存在很強的群體分化。本研究中，DB-MG和DB-YL品種對分別篩選到有112和109個“候選位點”。

DB-MG.德保矮馬和蒙古馬品種對；DB-YL.德保矮馬和伊犁馬品種對。下同DB-MG.Debao pony and Mongolian horse pair；DB-YL.Debao pony and Yili horse pair.The same as below圖2 DB-MG 和DB-YL的FST值經(jīng)驗分布圖Fig.2 The empirical distribution of FST of DB-MG and DB-YL

2.2.2 XP-EHH分析結果 用Lunix系統(tǒng)下的XP-EHH分析軟件(http：//hgdp.uchicago.edu/software/xpehh.tar)對試驗群體-對照群體對之間的XP-EHH進行計算，其頻率分布直方圖見圖3，可以看出雖存在一定程度的偏移，標準正態(tài)化后XP-EHH統(tǒng)計量近似服從標準正態(tài)分布。這與P.C.Sabeti等[16]研究一致，據(jù)此可對XP-EHH值進行顯著性檢驗，用R語言對XP-EHH值進行P值檢驗。DB-MG和DB-YL品種對之間分別檢測到77和55個“候選位點”(顯著水平P<0.05)。

2.3 整合分析

對兩種方法得出的結果進行整合，F(xiàn)ST計算的DB-MG和DB-YL品種對之間分別有112和109個顯著位點；用XP-EHH計算時DB-MG對之間有77個位點，DB-YL有55個。以上4個文件得到的顯著位點，出現(xiàn)兩次或以上的位點被視為“離群位點”，最后得到64個“離群位點”。結合X染色體FST和XP-EHH的結果，繪曼哈頓圖(圖4)，結果還發(fā)現(xiàn)X染色體的離群位點主要分布在染色體的兩端。

圖3 DB-MG和DB-YL的XP-EHH頻數(shù)分布Fig.3 The distribution of statistics frequency for XP-EHH in DB-MG and DB-YL

虛線是P<0.05顯著性水平的閾值Dotted line indicate the threshold at 0.05 significant level圖4 DB-MG和DB-YL之間X染色體選擇信號分布Fig.4 Distribution of selection signature identified on X chromosome in DB-MG and DB-YL

2.4 生物信息學分析

本研究綜合FST和XP-EHH兩種方法檢測X染色體選擇信號，將“離群位點”上下游各200 kb定義為選擇信號作用區(qū)域，對選擇信號區(qū)域進行注釋。注釋了208個基因，見表1。

3 討 論

近幾年，隨著高通量技術的應用，對受選擇位點進行全基因組捕獲已經(jīng)成為一種研究表型多樣性遺傳機制的有效方法。選擇信號檢測的方法主要有基于單位點頻譜、基于群體分化和基于連鎖不平衡和單倍型3大類?；谌后w間分化的FST能充分解釋品種間由于選擇帶來的差異，其基本假設是由于選擇目標不同造成的品種間差異體現(xiàn)在基因組水平上，差值越大表明群體之間分化程度越高[17]。XP-EHH是基于群體內(nèi)EHH的方法，結合等位基因與其附近的擴展單倍型的方法，因此可以更好地利用單群體信息，能有效的發(fā)現(xiàn)群體內(nèi)由于選擇留下的印記。但是由于群體背景的存在，僅僅計算FST會增加假陽性[18]，所以綜合幾種方法會提高選擇信號檢測的準確率。當用FST和XP-EHH兩種方法，以阿爾卑斯山脈的10個牛品種為研究對象時，找到與產(chǎn)奶和產(chǎn)肉相關的6個基因，TG、ABCG2、DGAT1、GH1、GHR和CaseinCluster[19]受到正選擇。在馬賽人的耐乳糖研究中，F(xiàn)ST、iHS、XP-EHH共同驗證，發(fā)現(xiàn)候選基因FABP1、LCT、CYP3A等與脂肪代謝和乳糖耐受癥相關，并提出長范圍的單倍型多樣性對選擇信號的檢測有更強的效力，并接近固定[20]。

表1 德保矮馬的選擇信號區(qū)域

Table 1 Selection signature identified in DB

起始位置/MbStartingposition終止位置/MbEndposition最大FSTMaxFST最大XP?EHHMaxXP?EHH候選基因Gene4．04．60．330．52PNPLA47．88．20．320．97U69．610．00．170．67GEMIN813．313．90．190．66SNORD112，CDKL5，RS1，PPEF1，SCML216．316．90．280．94MBTPS2，YY2，SMS，PHEX，ZNF64523．624．00．260．63NR0B1，CXHXORF21，GK28．629．00．160．25CXorf2232．132．50．230．50BCOR39．539．90．200．33TFE3，CCDC120，PRAF2，WDR45，GPKOW，MAGIX，PLP2，PRICKLE3，SYP，CACNA1F，CCDC22，F(xiàn)OXP3，PPP1R3F44．646．90．260．55IQSEC2，KDM5C，TSPYL257．958．30．200．66PGK1，TAF9B，CYSLTR1，ATP7A58．458．80．210．35LPAR459．660．00．190．56TBX22，CHMP1B，F(xiàn)AM46D64．765．40．210．44CHM，POF1B66．667．70．370．64KLHL482．783．40．320．55TEX13A86．687．00．170．59TMEM164，ACSL487．187．50．320．52RGAG1，CHRDL1，AMMECR1100．2100．80．260．61RPL7A106．2106．70．200．61GPC3107．9108．40．180．48DDX26B，SLC9A6，F(xiàn)HL1，MAP7D3123．1123．50．180．52GAB3，U6，DKC1，SNORA36，SNORA56，MPP1，SMIM9，F(xiàn)8，F(xiàn)UNDC2，MTCP1，BRCC3

字體顏色加深的基因是與生長相關的基因

Genes with deep color are related to growth

與常染色體相比X染色體的有效群體大小較小，但是分化程度較大[21]，這使得其能對群體歷史和選擇信號更敏感[22]，且主要區(qū)域在染色體的兩端(0～40和80～120 Mb[23])，尤其是0～40 Mb該區(qū)域被稱為X染色體的擬常區(qū)(PAR[24])，由于性別補償效應(SSDC)，PAR選擇信號的強度更大，有人推測該區(qū)域存在與生長相關的基因[25]。本研究的受選擇區(qū)域主要有兩個4.0～39.9和87.1～123.5 Mb，與之前的研究相符[26]。

在注釋的208個基因中選擇與生長相關的基因進行分析，篩選與骨骼生長及脂肪代謝相關的基因及通路。但是由于馬的基因組功能注釋有限，部分基因的功能在矮馬中尚未報道[27]。本研究采用人及其他哺乳動物的同源基因進行注釋，主要有以下6個：CHRDL1(Chordin-like protein 1 precursor)[28]是BMP家族的成員，在小鼠的脊髓BMP(Bone morphogenetic proteins)信號通路表達，是BMP4的受體抑制劑，影響哺乳動物的促進成骨細胞分化和骨細胞外基質(zhì)合成與分泌，在胚胎時期骨的形成中有重要的作用，會導致人的異位骨化[29]。BCOR(Glypican integral membrane protein) 是骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的抑制基因，BCOR基因的表達降低能促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化[30]。BCOR[31]在人的牙源性間充質(zhì)干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的表達，抑制骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)成骨分化。抑制BCOR的表達[32]，會造成牙質(zhì)生長缺陷和不全。并且，BCOR在成年小鼠和人體內(nèi)[33]廣泛的表達，BCOR是BCL6的轉錄共抑制因子，通過表觀遺傳的機制調(diào)控下游基因AP2a[34]的表達及干細胞分化調(diào)節(jié)和組織再生。AP2a[35]是一個轉錄激活因子，其組蛋白甲基化狀態(tài)影響骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化功能，從而對骨骼的生長產(chǎn)生影響。對豬的X染色體選擇信號研究也篩選到該基因[22]，并說明BCOR是早期胚胎形成的關鍵轉錄本。PHEX(Phosphate-regulating neutral endopeptidase)[36]基因突變是抗維生素D佝僂病的致病原因。其基因突變可導致腎小管和腸道對磷的轉運異常和重吸收障礙，導致大量磷浪費，出現(xiàn)低磷酸鹽血癥，維生素D代謝異常，腸道對磷、鈣的吸收不良而影響骨質(zhì)鈣化，形成佝僂病，表現(xiàn)為身材矮小，骨骼疼痛，牙齒發(fā)育不良等。V.Lampe[37]將漢諾威溫血馬的軟骨病QTL定位到該基因。Cacna1f基因突變會影響到骨骼肌-神經(jīng)肌接頭處的神經(jīng)遞質(zhì)釋放活性區(qū)，使神經(jīng)遞質(zhì)釋放受阻信號傳導阻滯，故導致神經(jīng)肌肉功能的改變。PNPLA4(Patatin-like phospholipase domain-containing protein 4) 在脂肪合成和分解代謝中有重要作用[38]，也與人的肥胖有關[39]。FGF家族在動物的細胞生長、分化以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)細胞的存活和再生方面起著多重作用，且?guī)缀趺總€成員都有很重要的功能。GPC3(Glypican integral membrane protein) 是隱性遺傳的過度生長基因[40]，對間皮細胞的生長有影響，共轉染試驗證明GPC3可以促進FGF與其受體結合來調(diào)節(jié)FGF信號通路，以及IGF-2，影響GH-IGF和GH-FGF生長軸基因的表達，從而對哺乳動物的生長進行調(diào)節(jié)[41]。在對Friesian矮馬[42]的侏儒性狀研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)。

除此之外，德保矮馬還篩選出與免疫、疾病相關的基因。DKC1(Dyskerin )[43]的錯義突變影響先天性胰島發(fā)育不良。TLR7(Toll-like receptor 7)可能參與了IBDV(法氏囊病病毒)感染早期的天然免疫反應過程[44]，引起漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡[45]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，喉神經(jīng)病變與身高相關[46]，并發(fā)現(xiàn)在X染色體上與生長相關的ITM2A基因?qū)Σ∽冇杏绊?。說明可能有一些疾病相關的基因影響到了矮馬的生長，也有可能是馬在培育過程中，有害的突變一并被保留了下來[47]。

4 結 論

本研究基于高密度SNP芯片信息，對德保矮馬的X染色體進行了選擇信號檢測，結果表明，在X染色體上體現(xiàn)出較大的選擇信號區(qū)段，4.0～39.9和87.1～123.5 Mb，候選區(qū)域含有CHRDL1、BCOR、PHEX、Cacna1f、PNPLA4和GPC3等與骨骼發(fā)育和脂肪代謝相關的基因，這些基因可能受到了正選擇作用。本研究通過對分化基因進行檢測探索，為影響個體大小的候選基因和致因突變深入挖掘提供基礎，但所得到的結果有待進一步的驗證以及對檢測出的候選基因功能還需深入研究。

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(編輯 郭云雁)

Detecting Selection Signatures on X Chromosome of Debao Pony

LIU Xue-xue1，ADLIJIANG Halik1，DONG Kun-zhe1，WANG Yue-yue1，PAN Jian-fei2，PU Ya-bin1，HE Xiao-hong1，MA Yue-hui1，JIANG Lin1*

(1.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The study aimed to screen the selection signatures on X chromosome of Debao pony.The Illumina Equine 65K SNP BeadChip was used to perform a X-chromosomal scan on Debao pony，Yili horses and Mongolian horses and obtain 2 339 SNPs with high quality.The result showed that，based on these SNPs，we detected 2 regions(4.0-39.9 and 87.1-123.5 Mb) under strong selection on the X chromosome of Debao pony by 2 different methods，F(xiàn)STand XP-EHH.The 2 detected regions contained 64 outliers overlapping genes includingBCOR，PHEX，PNPLA4 andGPC3，which are related to the body size and the bone development.The results indicate that genes associated with growth on X chromosome are subject to strong artificial selection pressure during the breeding of the smallest Chinese pony.A few of them are not reported before and could be important candidate genes in future study.

Debao pony；FST；XP-EHH；X chromosome；selection signatures

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.006

2015-01-15

農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目(ASTIP-IAS01)；國家自然科學基金項目(31272403)

劉雪雪(1991-)，女，山西臨汾人，碩士生，主要從事動物遺傳資源分子評價工作，Tel：010-62815884，E-mail：lxx_caas@163.com

*通信作者：蔣 琳，博士，研究員，主要從事動物遺傳資源分子評價工作，E-mail：lin.jiang.cas@gmail.com

S821；S821.21

A

0366-6964(2015)12-2161-08