富　麗，孫研研，薛夫光，劉冉冉，白　皓，常國斌，陳國宏，陳繼蘭*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部畜禽資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

公雞弱精癥相關(guān)候選基因的表達(dá)分析

富麗1，2，孫研研2，薛夫光2，劉冉冉2，白皓2，常國斌1，陳國宏1，陳繼蘭2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部畜禽資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

為了探究公雞弱精癥的發(fā)病機(jī)理，本研究對(duì)前期應(yīng)用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)(Digital gene expression，DGE)及生物信息學(xué)分析得到的與公雞弱精癥相關(guān)的6個(gè)候選基因(COX7B、PTGDS、hPGDS、SPAG6、WNT2、CCNF)進(jìn)行表達(dá)分析。選取300只42周齡的北京油雞公雞，進(jìn)行為期4周的精液品質(zhì)檢測(cè)，從中篩出弱精及正常個(gè)體各15只。采用RT-qPCR對(duì)這6個(gè)候選基因在兩組個(gè)體的睪丸組織的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COX7B、PTGDS在弱精組個(gè)體睪丸的表達(dá)量顯著高于正常個(gè)體(P<0.01)，WNT2、hPGDS、CCNF在弱精組個(gè)體的表達(dá)量顯著低于正常個(gè)體(P<0.05)，SPAG6在兩組睪丸中的表達(dá)量沒有顯著差異，該結(jié)果與DGE的結(jié)果相吻合。通過DGE篩選出與弱精癥相關(guān)的6個(gè)候選基因的表達(dá)模式在本研究的群體中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，可作為公雞弱精癥的重要候選基因，進(jìn)一步進(jìn)行功能分析與驗(yàn)證，為揭示公雞弱精癥的發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)。

弱精癥；候選基因；睪丸；數(shù)字基因表達(dá)譜；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

弱精子癥(Asthenospermia)是指精液中直線運(yùn)動(dòng)的精子(a和b級(jí))小于50%或a級(jí)運(yùn)動(dòng)的精子小于25%的病癥，是影響精液品質(zhì)的重要病癥[1]。目前，弱精癥的研究主要集中于人類。在家禽生產(chǎn)中，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年有5%～12%的種公雞因產(chǎn)精能力低下而遭淘汰[2]。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，一些中國地方雞，存在繁殖效率低下的顯著弱點(diǎn)，公雞精液量低于專門化高產(chǎn)品種25%～50%。因此，探究公雞弱精癥的發(fā)病機(jī)理，采取科學(xué)手段剔除地方雞中的弱精癥個(gè)體，提高整體精液水平，對(duì)于降低生產(chǎn)成本，加快推進(jìn)地方雞的良種化進(jìn)程，提高養(yǎng)殖效益具有重要意義。

人類相關(guān)研究表明，30%的男性不育是由基因突變和染色體異常等遺傳缺陷引起[3]。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于家禽弱精癥產(chǎn)生原因的研究主要集中在營養(yǎng)、環(huán)境、疾病等外在因素上[4-5]，對(duì)于遺傳方面的研究甚少。本研究室前期采用DGE，比較無精與正常公雞睪丸轉(zhuǎn)錄組差異，篩選出差異表達(dá)基因[6]。胡娟[7]發(fā)現(xiàn)，北京油雞SPAG6基因多態(tài)性及其單倍型與精子品質(zhì)存在相關(guān)。在本課題的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，選取弱精和正常公雞組，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)篩選到的6個(gè)重要的弱精癥相關(guān)候選基因：細(xì)胞色素C氧化酶7B (Cytochrome coxidase 7B，COX7B)、前列腺素D2合成酶21 kDa(Prostaglandin D2 synthase 21 kDa，PTGDS)、造血前列腺素D合成酶(Hematopoietic prostaglandin D synthase，hPGDS)、相關(guān)精子抗原6 (Sperm associated antigen 6，SPAG6)、無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員2 (Wingless-type MMTV integration site family member 2，WNT2)、細(xì)胞周期蛋白F (Cyclin F，CCNF)在睪丸組織的表達(dá)進(jìn)行分析和驗(yàn)證，以進(jìn)一步揭示弱精癥的發(fā)生機(jī)理。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)動(dòng)物來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗(yàn)基地。供試公雞300只在相同的飼養(yǎng)與管理?xiàng)l件下，從42周齡開始，進(jìn)行大群篩選試驗(yàn)。根據(jù)3周初步觀察篩選結(jié)果，選留精液量少、精液顏色淺而透明的公雞，以及相同數(shù)量的精液量多、精液顏色淺黃且不透明的正常公雞。隨后每3 d進(jìn)行定時(shí)定員的精液采集，精液品質(zhì)檢測(cè)，最終選擇出15只弱精和15只正常公雞。第47周開始，隨機(jī)挑選300只相同條件下生長的母雞，按照公母配比為1︰10進(jìn)行人工授精，每只公雞收集80～120個(gè)種蛋后進(jìn)行孵化，統(tǒng)計(jì)每只公雞的受精率。57周齡時(shí)，屠宰該30只公雞，迅速采集左側(cè)睪丸樣本，取中心部位樣本(長1.0 cm×寬1.0 cm×高0.5 cm)放入甲醛固定液(10%福爾馬林溶液)保存，用于組織切片制備與觀察。其余樣本液氮速凍后，于-80 ℃保存用于后續(xù)RT-qPCR試驗(yàn)。

1.1.2主要試劑福爾馬林溶液購自北京拓英坊科技有限公司；RNA提取Trizol試劑盒購自北京TianGen Biotech公司；PrimeScript RT reagent Kit 和SYBR GREEN 購自大連TaKaRa公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1精液品質(zhì)檢測(cè)人工按摩法采集精液，用帶刻度的采精杯測(cè)量收集精液，記錄精液量?；靹蚓海瞥刹Ｆ?，利用OLYMPUS CX31顯微鏡，160倍鏡下觀察精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，記錄精液中直線運(yùn)動(dòng)的精子占總精子數(shù)的百分率，即精子活力，并采用10級(jí)評(píng)分法記錄：快速直線運(yùn)動(dòng)的精子所占的比例為10%記為1分，20%記為2分；以此類推，得出精子活力統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.2組織切片觀察統(tǒng)計(jì)睪丸組織切片由北京博奧泰瑞生物技術(shù)公司制作，利用蘇木精-伊紅(HE)染色。組織切片在顯微鏡(Olympus CX31)100倍鏡下，每個(gè)樣本取10個(gè)視野觀察并統(tǒng)計(jì)生精小管中形態(tài)畸形生精小管所占的比例，在400倍鏡下觀察生精小管的形態(tài)完整性。

1.2.3睪丸總RNA的提取及cDNA的合成取弱精和正常各15個(gè)樣品，每個(gè)樣品為30～50 mg凍存睪丸組織，采用Trizol試劑法提取總RNA，并純化。檢測(cè)濃度并統(tǒng)一稀釋到1 000 ng·μL-1。試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.4引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI中雞的PTGDS、hPGDS、SPAG6、WNT2、COX7B、CCNF基因及內(nèi)參基因GAPDH的基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物(表1)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.5qPCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)以獲得的弱精和正常睪丸組織樣品的cDNA為模板，利用表1中的引物采用ABI7500型熒光定量PCR儀對(duì)COX7B、PTGDS、hPGDS、SPAG6、WNT2、CCNF和內(nèi)參基因GAPDH在弱精組與正常組中的表達(dá)量進(jìn)行分析。定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBRPremixExTaqII 10 μL，上、下游引物各(10 μmol·L-1) 1 μL，模板cDNA 2 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 5.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線收集信號(hào)為95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

表1引物信息

Table 1Primer pairs information

基因Gene登錄號(hào)Accessionnumber引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductssize退火溫度/℃AnnealingtemperaturePTGDSNM_204259.1F:ACGCTGCTCAGCATCCTGGGGCTGGR:CCTCTTCTCGCACTGTTCAC25159.3hPGDSNM_205011.1F:TTCAATCTGCGAGGAAGAGCR:CCTGATTCTCTGGCGAGGTA20360.6SPAG6NM_001199586.1F:GCGGGAGGCAGGTGTAATR:AGTGCTTCCAGTGCTCCA26159.0WNT2XM_416013.4F:GCTGAAGTCCTGCTCCTGTGR:CGGTTGTTGTGGAGGTTCAT18258.4COX7BXM_001235157.3F:ACAAACTCATCATCGCAAGCR:GGCTGTTACTCCCTCCATTC18058.8CCNFXM_415043.4F:TTCAAGCCTCCCGTCCTATR:ACTTCCACCAGCCAGTCAAC10060.0GAPDHNM_204305.1F:GGAGAAACCAGCCAAGTATGAR:ACCATCAAGTCCACAACACG24059.4

2　結(jié)　果

2.1弱精與正常個(gè)體的篩選

根據(jù)弱精定義和本研究中試驗(yàn)樣本篩選結(jié)果，將精子活力評(píng)分不超過5的歸為弱精個(gè)體，精子活力評(píng)分大于6的為正常個(gè)體。根據(jù)定義篩選出弱精組和正常組個(gè)體各15個(gè)。正常與弱精個(gè)體精子活力、精液量、受精率的統(tǒng)計(jì)數(shù)值如表2所示。可以看出，弱精組中個(gè)體精液量均少于400 μL，受精率在10%～50%，畸形生精小管的比例大于25%。正常組中個(gè)體精液量在600～1 000 μL，受精率不小于60%，畸形小管比例不超過20%。

2.2睪丸組織切片觀察與統(tǒng)計(jì)

低倍鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)畸形生精小管在視野中的比例，高倍鏡下觀察生精小管的形態(tài)完整性。可以觀察到弱精組中生精小管形態(tài)不完整(圖1a)；畸形小管較多；生精小管中各級(jí)生精細(xì)胞排布散亂(圖1b)，中央生成的精子很少。對(duì)比正常組生精小管形態(tài)完整排布緊密(圖1c)，各級(jí)生精細(xì)胞從外到內(nèi)有序排列，中央有較多精子生成(圖1d)。

2.3候選基因表達(dá)結(jié)果

使用RT-qPCR檢測(cè)候選基因的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，COX7B、PTGDS在弱精組表達(dá)量高于正常組，且兩者之間差異極顯著(P<0.01)；hPGDS、WNT2、CCNF在弱精組中表達(dá)量低于正常組，且兩者之間差異顯著(P<0.05)；SPAG6表達(dá)量在兩組間無顯著差異。

3　討　論

在人類醫(yī)學(xué)上，通過構(gòu)建基因表達(dá)譜來尋找精液品質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)已成為男性不育研究熱點(diǎn)[8-10]。畜禽上，雄性動(dòng)物的繁殖力很大程度上影響育種進(jìn)展和經(jīng)濟(jì)效益。王竹偉[6]采用DGE，檢測(cè)到有747個(gè)基因在雞無精癥和正常睪丸中表達(dá)存在2倍以上的差異。本研究從大群體里篩選多個(gè)新樣本，通過更為精確的檢測(cè)手段即RT-qPCR對(duì)之前的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，揭示弱精癥的可能發(fā)生的分子機(jī)理。結(jié)果表明，候選基因COX7B和PTGDS在弱精癥公雞睪丸中的表達(dá)量顯著上調(diào)；WNT2、hPGDS及CCNF基因的表達(dá)量則顯著下調(diào)；SPAG6基因在兩組中的表達(dá)量差異不顯著，該結(jié)果與DGE結(jié)果吻合，且差異表達(dá)的5個(gè)候選基因可能參與了弱精癥發(fā)生。

表2弱精組與正常組精液品質(zhì)和受精率

Table 2The semen quality and fertility rate of asthenospermia and normal roosters

組別Group精液量/μLSemenvolume精子活力Spermviability受精率/%Fertilityrate畸形生精小管比例/%Percentageofabnormaltesticularseminiferoustubules弱精Asthenospermia216.674.0020.7852.67233.333.6733.3352.00130.004.3318.9253.80163.333.3321.7830.50116.674.3332.2647.00200.002.6734.7841.00200.003.6733.0234.28366.672.3349.2842.00283.332.0012.5045.70366.674.3335.9029.64360.003.0036.1927.85156.674.3327.5336.00166.673.6730.0040.34150.002.6722.5232.00233.332.3319.1441.00平均Average222.89±85.11A3.38±0.82a28.5340.39正常Normal630.006.3370.833.02876.676.6775.7017.65666.677.6772.6316.00600.007.0078.135.00653.337.3374.3610.60716.677.0071.7815.23756.677.5072.6916.23583.337.5062.3913.04456.677.2774.6612.67716.677.7075.785.62750.007.6774.2318.21633.336.7372.5412.47600.007.0376.6611.67590.006.9374.6612.67600.008.0378.135.00平均Average655.33±98.24B7.22±0.46b73.6811.67

同列數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)

Different letters in the same columns means significant difference between the treatments(P<0.05)，same letter in the same columns means not significant difference between treatments(P>0.05)

圖1　弱精與正常公雞細(xì)精管切片圖(HE染色)Fig.1　Photomicrograph of seminiferous tubules of asthenospermia and normal roosters (H&E staining)

*.P<0.05；**.P<0.01圖2　候選基因PTGDS、hPGDS、SPAG6、WNT2、COX7、CCNF在弱精及正常公雞睪丸組織中的表達(dá)Fig.2　The expression of 6 candidate genes in asthenospermia and normal roosters

精子抗原(SPAG)是一類重要的功能蛋白，在調(diào)控哺乳動(dòng)物精子發(fā)生、精子運(yùn)動(dòng)、精子獲能和精卵結(jié)合等生物過程中發(fā)揮重要的作用。SPAG6蛋白是精子的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一，對(duì)維持成熟精子完整結(jié)構(gòu)很重要，同時(shí)有利于維持精子鞭毛活動(dòng)[11]。胡娟[7]研究表明，北京油雞SPAG6 基因多態(tài)性及其單倍型與精子品質(zhì)存在相關(guān)。然而本研究室前期DGE研究結(jié)果顯示，該基因在無精和正常個(gè)體睪丸組織中表達(dá)量并無顯著差異，本研究RT-qPCR也驗(yàn)證了該結(jié)果。通常位于基因調(diào)控區(qū)的SNP會(huì)影響基因表達(dá)量。SPAG6基因表達(dá)量分析與SNP關(guān)聯(lián)分析結(jié)論不一致的原因可能主要是前期發(fā)現(xiàn)的SNP都位于該基因的內(nèi)含子區(qū)域，并未引起該基因表達(dá)量的變化。

精子在精液中的果糖酵解是其首要能量來源，精子分解果糖的能力與精子的密度和活力相關(guān)[12]。弱精組中精子活力顯著低于正常組(表2)，從而精子分解果糖能力降低，需要啟動(dòng)或增加線粒體中氧化磷酸化和合成ATP的過程來為細(xì)胞供能。細(xì)胞色素c氧化酶(COX)是線粒體呼吸鏈電子傳遞的終末復(fù)合物，是線粒體氧化能力的關(guān)鍵酶[13]。其表達(dá)會(huì)隨著氧化磷酸化過程的增加而上調(diào)。這可能是在DGE和本研究的弱精個(gè)體睪丸組織中COX7B基因表達(dá)量明顯升高的原因(DGE結(jié)果顯示該基因?yàn)槿蹙Y個(gè)體中最上調(diào)表達(dá)的基因)。在人類上也有研究表明COX7a2在老年人睪丸中的表達(dá)顯著上調(diào)[14]。因此，COX7B基因在弱精癥個(gè)體的高表達(dá)可能不是弱精癥產(chǎn)生的原因，而是伴隨弱精癥發(fā)生的一種調(diào)控機(jī)制。此外，結(jié)合睪丸組織切片結(jié)果，弱精組生精小管畸形及不完整率較多，睪丸組織可能需要消耗更多的能量來生成成熟精子進(jìn)而導(dǎo)致COX7B表達(dá)量上調(diào)。

PTGDS和hPGDS是前期數(shù)據(jù)庫里差異表達(dá)基因，是本試驗(yàn)通過Gene Ontology分析獲得的顯著功能本體條目：前列腺素D合成酶活性(CorrectedP-value = 0.30)中包含的兩個(gè)重要基因。前列腺素D合成酶(PGDS)包括腦型PGDS(Lipocalin-PGDS，L-PGDS)和生血型PGDS(hPGDS)，兩者生化和免疫功能截然不同。L-PGDS即PTGDS，又叫谷胱甘肽非依賴性PGDS，是前列腺素合成酶系的主要成員之一，主要存在于雄性生殖道，在哺乳動(dòng)物的睪丸中高表達(dá)，可能在睪丸的發(fā)育、精子的發(fā)生及精子成熟等過程發(fā)揮重要的作用[15]。研究表明，少精子癥患者的精漿中L-PGDS的濃度顯著下降[16-17]。E.P.Diamandis等[18]認(rèn)為這可能是由睪丸組織生精管道的不通暢，精漿減少造成的。DGE及本研究均顯示該基因在弱精組的睪丸組織中明顯上調(diào)，推測(cè)可能是弱精個(gè)體精漿中L-PGDS的低濃度的負(fù)反饋?zhàn)饔么偈蛊湓诓G丸組織中基因的表達(dá)量升高，而生精管道的不通暢可能導(dǎo)致了精漿減少從而L-PGDS含量無法達(dá)到正常值。

hPGDS在不同物種間其表達(dá)部位也存在差異，小鼠中主要表達(dá)于輸卵管、皮膚組織中，大鼠中主要表達(dá)于輸卵管、脾、胸腺等，而在人的心、胎盤及胎兒肝等組織也有表達(dá)[15]。本研究中，發(fā)現(xiàn)hPGDS在雞的睪丸組織中也有表達(dá)，且在弱精組表達(dá)量顯著降低。在成年人的睪丸中該基因參與前列腺素生物合成途徑[15]，可以推測(cè)在雞hPGDS通過影響前列腺素的合成從而影響睪丸的正常功能和精子的生成。

Wnt信號(hào)通路是前期檢測(cè)到的差異表達(dá)基因顯著富集的通路。WNT2是該通路上的一個(gè)重要基因。WNT2主要與結(jié)直腸癌、胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌及惡性胸膜間皮癌等的發(fā)生有關(guān)，它參與調(diào)控特定基因的表達(dá)[19]。DGE結(jié)果顯示該基因在無精和正常個(gè)體中的表達(dá)差異達(dá)到28[6]，本研究也證明該基因在弱精個(gè)體中的表達(dá)量顯著低于正常組。揭示該基因可能參與調(diào)控睪丸組織的生精過程。DWnt2 (Drosophila Wnt2)是果蠅所特有的，是果蠅雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育所必須的，影響其睪丸的發(fā)生[20]。類似地可以推測(cè)Wnt2表達(dá)量的降低可能導(dǎo)致雞畸形生精小管的比例上升從而降低產(chǎn)精質(zhì)量。

細(xì)胞周期蛋白與有絲分裂、減數(shù)分裂密切相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白(CCNF)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期使其順利過度的重要功能，它保證細(xì)胞在支持細(xì)胞分裂的環(huán)境信號(hào)的作用下進(jìn)行正常增殖[21]。各級(jí)生精細(xì)胞周期間的轉(zhuǎn)換，及各級(jí)生精細(xì)胞的生成和精子都需要細(xì)胞周期蛋白[22]。在無精癥公雞睪丸組織中，CCNF基因表達(dá)顯著降低(圖2)，可能導(dǎo)致各級(jí)生精細(xì)胞周期的更替無法進(jìn)行，精子生成發(fā)生障礙。

精子發(fā)生過程經(jīng)歷了復(fù)雜的細(xì)胞分化階段，并受許多因素的影響。本研究應(yīng)用RT-qPCR對(duì)6個(gè)弱精癥重要候選基因的表達(dá)進(jìn)行了分析和驗(yàn)證，并進(jìn)一步探討了弱精癥的機(jī)制，對(duì)弱精癥的診斷和發(fā)生機(jī)理的揭示提供了重要基礎(chǔ)。

[1]Word Health Organization (WHO).Laboratory manual of the WHO for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction[J].Ann1stSuperSanita，2001，37(1)：Ⅰ-Ⅻ，1-123.

[2]陳蓉.禽類Piwill基因與piRNAs生物學(xué)功能的初步研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2013. CHEN R.Preliminary study on the biological function of Piwill gene and piRNAs in poultry[D].Yangzhou：Yangzhou University，2013.(in Chinese)

[3]HOPPS C V，MIELNIK A，GOLDSTEIN M，et al.Detection of sperm in men with Y chromosome microdeletions of the AZFa，AZFb，and AZFc regions [J].HumanReprod，2003，18(8)：1660-1665.

[4]NEUMAN SLEUMAN S L，ORBAN J I，LIN T L，et al.The effect of dietary ascorbic acid on semen traits and testis histology of male turkey breeders [J].PoultSci，2002，81(2)：265-268.

[5]VILLARREAL L Y，BRANDAO P E，CHACON J L，et al.Orchitis in roosters with reduced fertility associated with avian infectious bronchitisvirus and avian metapneumovirus infections [J].AvianDiseases，2007，51(4)：900-904.

[6]王竹偉.能蛋水平對(duì)北京油雞后期繁殖性能的影響及睪丸基因表達(dá)譜的建立[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011. WANG Z W.Effects of energy-protein levels on reproduction performance in late reproductive period of Beijing-You chickens and construction of gene-expression profiles in the testicular azoosperma[D].Lanzhou:Gansu Agricultural University,2011.(in Chinese)

[7]胡娟.北京油雞精液品質(zhì)遺傳參數(shù)估計(jì)及相關(guān)候選基因的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010. HU J.Estimation of genetic parameters and association analysis of relevant candidate genes with semen quality in Beijing-You chicken[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2010.(in Chinese)

[8]LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method [J].Methods，2001，25(4)：402-408.

[9]陳德宇，劉利敏，謝慶東，等.弱精癥患者精子基因表達(dá)譜的建立及分析[J].癌變·畸變·突變，2009，21(4)：286-290. CHEN D Y，LIU L M，XIE Q D，et al.Construction and analysis of gene-expression profiles in the sperms of patients with asthenospermia[J].Carcinogenesis，Teratogenesis&Mutagenesis，2009，21(4)：286-290.(in Chinese)

[10]劉利敏.無精癥精子mRNA和miRNA差異表達(dá)譜的構(gòu)建與分析[D].汕頭：汕頭大學(xué)，2009. LIU L M.Generation and analysis of mRNA and miRNA differential expression profiles in sperm of patients with asthenospermia[D].Shantou：Shantou University，2009.(in Chinese)

[11]SAPIRO R，KOSTETSKII I，OLDS-CLARKE P，et al.Male infertility，impaired sperm motility，and hydrocephalus in mice deficient in sperm-associated antigen 6[J].MolCellBiol，2002，22(17)：6298-6305.

[12]劉克鋒，王瑞，李銳，等.不育癥患者精漿果糖水平測(cè)定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，4(3)：495-496. LIU K F，WANG R，LI R，et al.Determination of seminal fructose in patients with infertility[J].JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences)，2009，4(3)：495-496.(in Chinese)

[13]OSTERMEIER C，IWATA S，MICHEL H.Cytochrome c oxidase [J].CurrentOpinStructuralBiol，1996，6(4)：460-466.

[14]辛鐘成，劉武江，田龍，等.老年人睪丸組織退化的基因表達(dá)譜研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，35(4)：364-368. XIN Z C，LIU W J，TIAN L，et al，Studies on the testis regression related gene profile in aged male[J].JournalofPedingUniversity(HealthSciences)，2003，35(4)：364-368.(in Chinese)

[15]胡士軍，朱輝，楊增明.前列腺素D2及其受體與哺乳動(dòng)物生殖[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2004，39(3)：91-96. HU S J，ZHU H，YANG Z M.Prostaglandin D2 and its receptor in mammalian reproductive system[J].ChineseJournalofZoology，2004，39(3)：91-96.(in Chinese)

[16]TOKUGAWA Y，KUNISHIGE I，KUBOTA Y，et al.Lipocalin-type prostaglandin D synthase in human male reproductive organs and seminal plasma [J].BiolReprod，1998，58(2)：600-607.

[17]GERENA R L，IRIKURA D，URADE Y，et al.Identification of a fertility-associated protein in bull seminal plasma as lipocalin-type prostaglandin D synthase [J].BiolReprod，1998，58(3)：826-833.

[18]DIAMANDIS E P，ARNETT W P，F(xiàn)OUSSIAS G，et al.Seminal plasma biochemical markers and their association with semen analysis findings [J].Urology，1999，53(3)：596-603.

[19]吳堃，李輝，朱卓立，等.Wnt2在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33(6)：757-762. WU K，LI H，ZHU Z L，et al.Wnt2 expression in Hepatocellular Carcinoma and its inhibitory effect on the proliferation of HepG2[J].Basic&ClinicalMedicine，2013，33(6)：757-762.(in Chinese)

[20]MILLER J R，MILLER.TheWnts[J].GenomeBiol，2002，3(1)：3001.1-3001.15.

[21]戴愛玲.細(xì)胞周期調(diào)控因子的研究進(jìn)展[J].龍巖師專學(xué)報(bào)，2002，20(3)：53-54. DAI A L.A review of research progress of cell cycle modulators[J].JournalofLongyanTeachersCollege，2002，20(3)：53-54.(in Chinese)

[22]俞作仁.小鼠精子發(fā)生不同階段生精細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2003. YU Z R.Gene expression p rofiles in dieffrent stages of mouse spemratogenie cells during spemratogenesis[D].Beijing：Peking Union Medical College，2003.(in Chinese)

(編輯郭云雁)

The Expression of the Six Candidate Genes for Asthenospermia of the Rooster

FU Li1，2，SUN Yan-yan2，XUE Fu-guang2，LIU Ran-ran2，BAI Hao2，CHANG Guo-bin1，CHEN Guo-hong1，CHEN Ji-lan2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.NationalKeyLaboratoryofAnimalResourcesandGermplasmInnovation，InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

To explore the pathogenesis of the rooster asthenospermia，the expression profiles of 6 candidate genes (COX7B，PTGDS，hPGDS，SPAG6，WNT2 andCCNF) selected from the previous digital gene expression profiling (DGE) and bioinformatics analysis，were analyzed.A total of 300 Beijing-You roosters of 42 weeks were detected for 4 weeks for semen quality including semen volume，sperm mobility，etc.Fifteen asthenospermia and 15 normal roosters were selected accordingly.Real-time quantitative PCR were performed to determine the expression of the 6 genes in the testicular of those roosters.The results indicated thatCOX7BandPTGDSwere significantly high-expressed in the asthenospermia group (P<0.01)，while theWNT2，hPGDSandCCNFwere significantly low-expressed in the asthenospermia group (P<0.05).However，the expression ofSPAG6 gene was not significantly different in the 2 groups.These results were in accordance with the previous DGE analysis.The expression patterns of the 6 genes identified from DGE for asthenospermia in chickens were validated in the present study.They can be important candidate genes for further functional study and revealing the mechanism of chicken asthenospermia.

asthenospermia；candidate gene；testis；digital gene expression profiling；RT-qPCR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.003

2014-08-15

國家自然科學(xué)基金(31372304)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS04)

富麗(1988-)，女，山東煙臺(tái)人，碩士，主要從事家禽分子遺傳研究，Tel：010-62816005，E-mail：momomook@126.com

*通信作者：陳繼蘭，研究員，E-mail：Chen.jilan@163.com

S831；S813.3

A

0366-6964(2015)06-0889-07