于春生，張雨竹，張風嬌，宋志儒，楊 月，孫冬梅＊，李 敏

（1.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319；2.東華理工大學化學生物與材料科學學院，南昌 330013）

木霉（Trichodermaspp.）是一類重要的生防菌［1］，至少對18個屬29種植物病原真菌有拮抗作用，一些木霉菌株已被開發(fā)出木霉制劑，用于農業(yè)生產。哈茨木霉（T.harzianum）是木霉屬中常見種，可定殖于植物根部，降低根際有害菌群及有毒化合物的活性，并能夠溶解土壤中的營養(yǎng)物質，促進植物對養(yǎng)分的吸收，提高氮的利用率，從而促進植物生長，提高作物產量［2-3］。哈茨木霉對植物病原真菌具有重寄生作用、抗生作用、競爭作用，并能誘導植物產生抗性［4］，被認作是最具潛力的生物防治因子之一［5］。就目前國內農業(yè)發(fā)展狀況來看，生物農藥還無法完全代替化學農藥，化學殺菌劑還占據很大的市場［6］。多菌靈是一種苯并咪唑類廣譜性化學殺菌劑，對多種由真菌（如半知菌、子囊菌）引起的作物病害有防治效果，是目前廣泛應用的化學農藥之一。作為生防微生物，哈茨木霉野生型菌株在噴施和殘留多菌靈的環(huán)境中存活不理想，因此無法發(fā)揮其生防作用。本研究采用紫外線-氯化鋰復合誘變法［7］，誘導哈茨木霉產生對多菌靈的抗性，使之既不受多菌靈影響，又能發(fā)揮生防作用，達到防治植物病害的同時有效減少多菌靈的使用，減少化學農藥對環(huán)境的危害［8］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

拮抗菌哈茨木霉（T.harzianum）菌株hc，病原菌立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）、茄鐮孢菌（Fusariumsolani）、核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）和茄鏈格孢菌（Alternariasolani），均由黑龍江八一農墾大學生命學院提供。

1.1.2 供試藥劑

25%多菌靈可濕性粉劑，山東鄉(xiāng)村生物科技有限公司。

1.1.3 試驗儀器

DL-CJ-2N醫(yī)用型潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；電子天平；BA310Motic數碼顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基制作

PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、蔗糖20g、水1 000mL、瓊脂粉15g，pH 自然；藥物培養(yǎng)基：PSA 培養(yǎng)基中加入一定濃度的25%多菌靈可濕性粉劑；誘變培養(yǎng)基：在含多菌靈的藥物培養(yǎng)基中加入定量氯化鋰。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉的耐藥性測定

采用含毒介質培養(yǎng)法［9］，稱取多菌靈，加無菌水配成濃度為24、36、60、72、84μg／mL的母液，待PSA培養(yǎng)基（每三角瓶59mL）冷卻至50 ℃左右時分別加入1 mL上述濃度的母液，使培養(yǎng)基中多菌靈的最終濃度達到0.4、0.6、1.0、1.2、1.4mg／L，充分混勻后，均勻倒入3個平皿中。以加入等量無菌水的PSA 培養(yǎng)基作對照。培養(yǎng)基凝固后用直徑5mm［16］的打孔器切取哈茨木霉菌碟，菌絲面朝下［11］接種于含不同濃度多菌靈平板培養(yǎng)基中央，將各處理置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，十字交叉法［12］測量菌落直徑，計算抑菌率。

以多菌靈濃度對數值為自變量（x），相對抑制率的幾率值為因變量（y），線性回歸法求出毒力回歸方程和決定系數。由毒力回歸方程，令y＝5（即抑制率為50%的幾率值），查反常用對數表得出的x值即為有效抑制中濃度EC50［13］。

1.2.2 哈茨木霉的氯化鋰-紫外復合誘變以及突變菌株的篩選

在PSA 平板培養(yǎng)基上接種哈茨木霉出發(fā)菌株hc，25℃培養(yǎng)7d，待產生大量綠色孢子后，用移液槍吸取無菌水沖洗孢子，制成孢子懸浮液，利用血球計數板計算孢子數量，并稀釋至106個／L［14］。以單獨進行紫外照射與氯化鋰誘變時致死率分別為80%［15］左右的劑量進行復合誘變。將菌懸液置于20 W 紫外燈下30cm 處照射3min，避開其他光源［13］，然后在紅燈下取0.1 mL 菌懸液涂布于含有0.01%氯化鋰，3 mg／L多菌靈的平板上，共涂150個平板；同時取0.1 mL未經紫外線照射的菌懸液涂布于不含氯化鋰和多菌靈的平板上作為對照，對照涂5個平板，用黑紙包好平板在避光條件下培養(yǎng)［16］。計算正突變率。

正突變率（%）＝含藥平板中突變菌株菌落個數／未做任何處理不含藥平板中出發(fā)菌株菌落個數×稀釋倍數×100。

培養(yǎng)5d后，選取含藥平板上長出的直徑大于1cm的菌落，打取直徑5 mm 的菌碟接于含多菌靈濃度更高（3.5 mg／L）的PSA 平板上，25℃恒溫培養(yǎng)，最終選出生長速率最快的菌落即為抗藥性最強菌株［17］，編號為hcb-35。

1.2.3 突變菌株抗藥能力檢測

利用菌絲生長速率法檢測多菌靈對抗性突變株hcb-35有效抑菌中濃度，有效中濃度計算方法同1.2.1。

1.2.4 哈茨木霉突變株hcb-35的抗藥遺傳穩(wěn)定性

將篩選出的哈茨木霉突變菌株hcb-35 接種于PSA 平板上，每7d傳代1次，連續(xù)轉接12次，每3代進行1次抗藥性測定，分別標記為hcb-35-3、hcb-35-6、hcb-35-9、hcb-35-12，以hcb-35菌株作對照，比較傳代過程中多菌靈對其有效抑菌中濃度的變化。

1.2.5 哈茨木霉出發(fā)菌株及突變株與病原菌的拮抗試驗

采用平板對峙培養(yǎng)法。分別從培養(yǎng)3d的哈茨木霉出發(fā)菌株hc、突變菌株hcb-35和病原菌上打取直徑5mm 的菌碟，并將拮抗菌與病原菌菌碟放置于經過平皿圓心相距4cm［18］的位置上進行對峙培養(yǎng)，同時設只接病原菌的培養(yǎng)皿作對照，每處理3次重復，置于25 ℃溫箱中培養(yǎng)。逐日觀察病原菌和哈茨木霉的生長狀況。待對照菌落長滿皿后測量處理病原菌菌落半徑，計算抑菌率。

I代表抑菌率，C為對照皿中病原菌菌落半徑，T為病原菌指向哈茨木霉菌落的半徑［19］。當兩菌落接觸后，觀察記錄哈茨木霉對病原菌的抑制、包圍、侵入并占領病原菌營養(yǎng)空間的過程。統(tǒng)計哈茨木霉對病原菌的拮抗系數，拮抗系數的分級標準［20］如下：

1級：木霉菌絲面積占據100%平皿面積；2級：2／3平皿面積≤木霉菌絲面積＜100%平皿面積；3級：1／3平皿面積≤木霉菌絲面積＜2／3平皿面積；4級：0＜木霉菌絲面積＜1／3平皿面積；5級：病原菌菌絲面積占據100%平皿面積。

1.2.6 哈茨木霉出發(fā)菌株和突變株對病原菌的重寄生作用

將載玻片上均勻蘸一層水瓊脂，凝固后在載玻片兩端分別接哈茨木霉出發(fā)菌株與病原菌、哈茨木霉突變菌株與病原菌菌碟，置于滅菌的培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，待兩菌落菌絲接觸時于顯微鏡下觀察兩者菌絲的相互作用。

2 結果與分析

2.1 哈茨木霉的氯化鋰-紫外復合誘變

預試驗結果表明，單獨采用紫外照射3min，木霉致死率為82%，單獨采用氯化鋰誘變，氯化鋰濃度0.01%時，致死率為79%。選擇紫外照射時間3 min，氯化鋰濃度0.01%進行氯化鋰-紫外復合誘變，得到315株抗性突變菌株。經計算正突變率為0.000 89%。通過藥劑篩選，獲得1 株抗藥性較強的突變菌株hcb-35。

2.2 哈茨木霉出發(fā)菌株與突變菌株的抗藥性

對哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變株hcb-35進行抗藥性測定，結果如表1所示，多菌靈對哈茨木霉出發(fā)菌株hc的有效抑菌中濃度為0.966mg／L，對菌株hcb-35的抑菌中濃度達到3.72mg／L，有效抑菌中濃度提高285%。

表1 哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35對多菌靈的抗性Table 1 Resistance of Trichoderma harzianumstarting strain hc and mutant strain hcb-35to carbendazim

2.3 哈茨木霉突變株的抗藥遺傳穩(wěn)定性

對哈茨木霉突變菌株進行抗藥遺傳穩(wěn)定性測試，結果如表2所示，隨著傳代次數的增加，多菌靈對哈茨木霉突變菌株的有效抑菌中濃度沒有明顯降低，抗藥遺傳穩(wěn)定性較好。

表2 哈茨木霉突變菌株抗藥遺傳穩(wěn)定性Table 2 Determination of the genetic stability of carbendazim-resistance in Trichoderma harzianum mutant strains

2.4 哈茨木霉出發(fā)菌株及突變株對病原菌的拮抗作用

圖1為哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35對4 種病原真菌的拮抗情況。對照組立枯絲核菌、茄鐮孢菌、核盤菌長滿皿時，哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35均未完全覆蓋病原菌菌落；而對照組茄鏈格孢菌尚未長滿皿時哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35均完全覆蓋病原菌菌落，并占據100%平皿面積。由表3 可知，哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35對立枯絲核菌、茄鐮孢菌、核盤菌和茄鏈格孢菌的抑制率不同，但對同一病原菌抑制率相近，如在對茄鏈格孢菌的抑制中，最高均可達100%。觀察發(fā)現，哈茨木霉出發(fā)菌株hc和突變菌株hcb-35在與不同病原菌菌落接觸之后，經不同時間后，在兩菌交界處的病原菌菌絲漸漸被哈茨木霉的菌絲消融萎縮，直至被哈茨木霉孢子完全覆蓋，如立枯絲核菌和茄鏈格孢菌被覆蓋時間為接觸后2d，核盤菌被覆蓋時間為接觸后5d，茄鐮孢菌被覆蓋時間為接觸后10d，表明hcb-35菌株拮抗能力沒有因抗性突變而降低。

圖1 哈茨木霉出發(fā)菌株hc及突變菌株hcb-35對幾種病原真菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic action of Trichoderma harzianumstarting strain hc and mutant strain hcb-35to several pathogenic fungi

表3 哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35對幾種病原真菌的拮抗作用Table 3 Antagonistic action of Trichoderma harzianumstarting strain hc and mutant strain hcb-35to several pathogenic fungi

2.5 哈茨木霉出發(fā)菌株及突變菌株對病原菌的重寄生作用

顯微鏡下可觀察到哈茨木霉突變菌株hcb-35和出發(fā)菌株hc對立枯絲核菌（R.solani）的纏繞現象（圖2），表明哈茨木霉突變株仍然具有對植物病原真菌的寄生作用。

圖2 哈茨木霉及其突變株對立枯絲核菌的重寄生作用（10×40）Fig.2 Hyperparasitism of Trichoderma harzianum and its mutant strain against Rhizoctonia solani（10×40）

3 結論與討論

本試驗利用氯化鋰-紫外復合誘變與含藥平板培養(yǎng)基篩選的方法成功獲得對殺菌劑多菌靈具有較高抗性的哈茨木霉突變菌株hcb-35，利用毒力測定法測得多菌靈對其有效抑菌中濃度為3.72 mg／L，較出發(fā)菌株hc提高285%。抗藥遺傳穩(wěn)定性結果表明，哈茨木霉抗藥性突變菌株的抗性可穩(wěn)定遺傳。拮抗試驗與顯微鏡觀察菌絲互作結果表明，哈茨木霉突變株hcb-35仍具備出發(fā)菌株hc對病原真菌的拮抗作用，且拮抗能力沒有降低。

哈茨木霉因其在生物防治與環(huán)境保護領域的應用潛力［21］而備受矚目。自1932年Weindling［22］發(fā)現木素木霉具有生防作用以來，人們在對木霉的生防應用、生物菌劑的開發(fā)以及生防機制等方面做了許多嘗試和深入的研究［23］。木霉雖然具有很強的生防能力，但因其制劑較難與當前普遍使用的化學農藥混配使用，從而使木霉制劑的推廣應用受到一定的限制［24］。通過誘變木霉產生對化學農藥的抗性很好地解決了木霉與化學殺菌劑不可共同施用的難題。王勇等［25］采用藥劑馴化法篩選獲得了抗速克靈拮抗菌株。然而單純地通過藥劑篩選獲得抗藥性木霉菌株，在數量及功能上遠遠不能滿足應用需要［8］。采用微波、紫外線、X 射線、化學藥物等手段都可以導致病原菌遺傳性狀的改變，構建高效的木霉菌株，其中紫外線［26］應用最為廣泛，且往往與其他方法復合使用。紫外線-氯化鋰復合誘變對獲得抗性菌株而言是一種簡便易行的手段，相比單一因素誘變的方法效果更佳，更易篩選出適合生產應用的優(yōu)良菌株［7，13，27］。本試驗通過氯化鋰與紫外線復合誘變的方法篩選出多菌靈對其有效抑菌中濃度（EC50）提升285%的哈茨木霉突變株hcb-35，且抑菌能力不弱于出發(fā)菌株hc，與田連生［16］的研究相符。哈茨木霉的抗藥性誘變，為與殺菌劑多菌靈混配應用奠定了基礎，使生防菌哈茨木霉的應用更加契合現階段農業(yè)生產的水平，彌補化學殺菌劑的不足，發(fā)揮強大生防能力的同時減少化學殺菌劑的使用，對降低環(huán)境污染，發(fā)展綠色農業(yè)有著積極的促進作用，也為其他生防菌的抗藥性誘變與應用提供了理論和實踐經驗。

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