周佳民，黃文坤，崔江寬，蘇致衡，彭德良＊

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源利用研究所，長(zhǎng)沙 410125；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

大豆孢囊線蟲(chóng)病是大豆生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，其病原為土傳的大豆孢囊線蟲(chóng)（HeteroderaglycinesIchinohe）［1-3］。目前生產(chǎn)上主要是種植抗性品種、與非寄主作物輪作以及應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。這些措施雖具有一定的防治效果，但因品種單一使大豆的抗性喪失及環(huán)境污染等問(wèn)題受到了很大的限制。因此，充分調(diào)查和挖掘出更多、更有效的新殺線蟲(chóng)植物將成為未來(lái)發(fā)展的方向［4］。

目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的對(duì)植物寄生線蟲(chóng)有活性的植物有40多科近100種［5］，但自然界植物資源極為豐富，許多具有殺線蟲(chóng)作用的植物還未被發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定8種藥用植物甲醇和無(wú)菌水提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)抑殺效果，初步篩選出對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)抑殺具有生物活性的植物，旨在為尋找新型植物源殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物及溶劑

供試的8種藥用植物經(jīng)湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院朱校奇研究員鑒定（表1），所用提取溶劑分別為甲醇及無(wú)菌水。

表1 供試植物名錄Table 1 The list of tested plants

1.1.2 供試線蟲(chóng)

大豆孢囊線蟲(chóng)從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院河北廊坊基地大豆種植地的土壤中分離。用漂浮法分離后在解剖鏡下挑取新鮮、飽滿的孢囊，用0.5%的次氯酸鈉處理3 min，再用無(wú)菌水沖洗3 次，置于0.5 mmol／L ZnSO4溶液中，在25 ℃恒溫條件下進(jìn)行孵化，得到2 齡幼蟲(chóng)（J2），收集并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?-7］。

1.2 方法

1.2.1 植物活性成分提取

參照李大婧的超聲波提取法［8］分別采用甲醇和無(wú)菌水從植物中提取活性成分。將采集的植物用純凈水洗凈、晾干水分，放入105 ℃電熱鼓風(fēng)箱內(nèi)殺青30min，然后在50℃下烘干，粉碎機(jī)粉碎并過(guò)40目篩網(wǎng)，得到植物干粉為待測(cè)樣品。稱取樣品10.0 g于三角瓶中，分別以甲醇和無(wú)菌水為提取溶劑，加入100mL提取溶劑，室溫下超聲波提取30min，浸泡提取48h后，用濾紙過(guò)濾提取液，吸取提取液5 mL并用無(wú)菌水定容至100mL為室內(nèi)待測(cè)液。

1.2.2 毒殺活性測(cè)定

將收集到的2齡幼蟲(chóng)加入無(wú)菌水，配制成濃度約為500條／mL 的線蟲(chóng)懸浮液，吸取1 mL 線蟲(chóng)懸浮液注入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1個(gè)樣品孔內(nèi)，再加入待測(cè)提取液1 mL，以相應(yīng)的提取液為對(duì)照，重復(fù)4次。處理48h，滴加1mol／L 的氫氧化鈉溶液檢查各處理的線蟲(chóng)死亡情況，線蟲(chóng)死亡計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)參考以下的方法，即線蟲(chóng)呈僵直不動(dòng)為死蟲(chóng)，線蟲(chóng)呈彎曲蠕動(dòng)狀態(tài)為活蟲(chóng)［9］。殺線蟲(chóng)強(qiáng)弱分級(jí)按Chandravadana等的方法進(jìn)行［10-11］。具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：“-”表示無(wú)活性，校正死亡率≤10.0%；“＋”表示弱活性，校正死亡率為10.1%～30.0%，“＋＋”表示中等活性，校正死亡率為30.1%～50.0%；“＋＋＋”表示較強(qiáng)活性，校正死亡率為50.1%～80%；“＋＋＋＋”表示強(qiáng)活性，校正死亡率＞80.0%。

1.2.3 盆栽試驗(yàn)

室內(nèi)盆栽以每種藥用植物的每種提取液為1個(gè)處理，每處理4次重復(fù)。試驗(yàn)土壤取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所河北廊坊基地大豆孢囊線蟲(chóng)發(fā)病嚴(yán)重的田塊，裝入盆口直徑27cm，高30cm 的塑料盆內(nèi)，混勻后稱取土樣200g，重復(fù)4次，采用漂浮法收集孢囊，在體視解剖鏡下記錄處理前孢囊的數(shù)量；5月10日，每盆播種10粒，大豆品種為市售‘中黃13’，出苗后定苗5株，在20～35℃條件下培養(yǎng)吸取20mL 各處理的提取液，稀釋到400mL，分別在播種前、苗期以灌根方式施藥2次。分別以甲醇稀釋液400mL和純凈水400mL為對(duì)照。

1.2.4 取樣及調(diào)查方法

大豆出苗60d后，測(cè)定大豆植株的株高，調(diào)查各種提取液對(duì)大豆生長(zhǎng)的影響。在大豆開(kāi)花期，采集大豆植株全部根系及根系周圍的土壤，混勻后稱取土樣200g，采用漂浮法收集孢囊，在體視解剖鏡下記錄孢囊的數(shù)量，重復(fù)4次，統(tǒng)計(jì)分析各處理對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)病的防治效果［12］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所測(cè)數(shù)據(jù)用DPS軟件和Excel軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)算公式如下［12-14］：

死亡率（%）＝（死亡線蟲(chóng)數(shù)／供試線蟲(chóng)數(shù)）×100；

校正死亡率（%）＝［（處理組線蟲(chóng)死亡率-對(duì)照組線蟲(chóng)死亡率）／（1-對(duì)照組線蟲(chóng)死亡率）］×100；

孢囊減退率（%）＝（施藥前孢囊數(shù)-施藥后孢囊數(shù)）／施藥前孢囊數(shù)×100；

防治效果（%）＝［（防治區(qū)孢囊減退率-對(duì)照區(qū)孢囊減退率）／（100-對(duì)照區(qū)孢囊減退率）］×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)活性評(píng)價(jià)

從表2可見(jiàn)，藥用植物青蒿甲醇和無(wú)菌水提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)毒殺能力最強(qiáng)，處理48h線蟲(chóng)的校正死亡率分別為94.23%和82.15%，薄荷、苦楝、臭椿、水蓼、商陸、小飛蓬等藥用植物提取液的毒殺活性次之，其甲醇提取液處理48h后，線蟲(chóng)的校正死亡率分別為76.94%、76.80%、75.00%、76.69%、86.93%、46.15%；無(wú)菌水提取液處理48h后，線蟲(chóng)的校正死亡率分別為63.58%、69.05%、76.23%、63.62%、55.05%、21.16%；卷丹甲醇提取液表現(xiàn)中等的殺蟲(chóng)能力，處理48h 線蟲(chóng)的校正死亡率為47.89%，藥用植物小飛蓬無(wú)菌水提取液表現(xiàn)出較弱的殺蟲(chóng)能力，處理48h校正死亡率為21.16%，卷丹無(wú)菌水提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)抑殺效果不理想，不表現(xiàn)活性或活性較弱，處理48h 的校正死亡率為2.51%；與卷丹和小飛蓬相比，青蒿、薄荷、苦楝、臭椿、水蓼、商陸等處理對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)抑殺效果均存在顯著差異。

表2 植物提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)活性1）Table 2 Toxicity of plant extracts to Heterodera glycines J2

2.2 不同植物提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)的盆栽防效

通過(guò)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物提取液各處理的土壤中孢囊數(shù)量比對(duì)照明顯減少，植物提取液各處理對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)的防治效果，與對(duì)照均存在顯著差異；其中，水蓼甲醇提取液與無(wú)菌水提取液處理對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)的防治效果均最好，分別為72.37%和57.10%（表3），與除臭椿外其他處理存在顯著差異；另外，同一植物提取液處理中，甲醇提取液處理的防治效果比無(wú)菌水提取液的有增高的趨勢(shì)，尤其是水蓼和臭椿甲醇提取液對(duì)線蟲(chóng)防治效果都達(dá)到65.79%以上，與其他處理存在顯著差異，具有較好的生防潛力。從表3還可以看出，各處理株高比對(duì)照有增高的趨勢(shì)但沒(méi)有顯著差異。

表3 植物提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)的防病效果Table 3 Control efficacy of plants extracts against Heterodera glycines

3 結(jié)論與討論

大豆孢囊線蟲(chóng)病是一種土傳病害，減少孢囊在土壤中的積累，抑制孢囊線蟲(chóng)卵孵化，是防治大豆孢囊線蟲(chóng)病的有效途徑。我國(guó)具有豐富的藥用植物資源，從植物中分離、提純殺線蟲(chóng)化合物，開(kāi)發(fā)高效、環(huán)保型的植物源殺線蟲(chóng)劑防治大豆孢囊線蟲(chóng)，有很好的現(xiàn)實(shí)和生態(tài)意義。本試驗(yàn)測(cè)定了8種藥用植物甲醇和無(wú)菌水提取液的殺線蟲(chóng)活性，結(jié)果表明薄荷、苦楝、臭椿、水蓼、商陸等藥用植物甲醇和無(wú)菌水提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒殺活性，尤其是藥用植物青蒿的甲醇和無(wú)菌水提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)均表現(xiàn)出極強(qiáng)的毒殺活性。前人測(cè)定了苦楝提取物對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的毒殺活性，結(jié)果表明，苦楝的乙醇提取物有較強(qiáng)的殺線活性［15-16］，Adegbite 等［17］的研究認(rèn)為，楝樹(shù)的提取物具有很好的殺線活性，是一種廉價(jià)和有效的殺線蟲(chóng)劑原料，但翁群芳等［18］的研究認(rèn)為，苦楝、青蒿的提取液對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的毒殺活性較弱。本研究通過(guò)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水蓼、臭椿甲醇提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)病防治效果好，具有較好的生防潛力，豐富了前人的研究結(jié)果。本試驗(yàn)還表明，各植物提取液處理株高比對(duì)照有增高的趨勢(shì)但差異不顯著，說(shuō)明植物提取液對(duì)大豆的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有不利影響，為水蓼、臭椿等植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

在本試驗(yàn)研究中，薄荷、苦楝、水蓼、商陸、小飛蓬、青蒿、卷丹等藥用植物甲醇提取液對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)的毒殺活性均優(yōu)于無(wú)菌水提取液，這可能是因?yàn)檫@些藥用植物中的某種功能性成分易溶于有機(jī)溶劑［19-21］；本試驗(yàn)對(duì)部分藥用植物提取物的殺線蟲(chóng)活性進(jìn)行了研究，但起作用的殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)的成分及其作用機(jī)理以及對(duì)土壤微生物的影響還有待進(jìn)一步研究。

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