西安交通大學第一附屬醫(yī)院皮膚科( 西安710061)

劉文麗 張 鍵 穆 欣 劉 彤△

Smad3和Smad7蛋白在硬皮病患者皮損中的表達及意義*

西安交通大學第一附屬醫(yī)院皮膚科( 西安710061)

劉文麗 張 鍵 穆 欣 劉 彤△

目的: 探討Smad3和Smad7在硬皮病發(fā)病機制中的作用。方法: 采用免疫組化SP法檢測46例硬皮病患者皮損中Smad3與Smad7蛋白的表達，以15例正常皮膚組織作為對照。結(jié)果: 與對照組相比，Smad3蛋白在硬皮病患者皮損中明顯升高(P<0.01)，Smad7蛋白表達則降低(P<0.01)；正常對照組皮膚中，Smad3與Smad7表達呈正相關(guān)(r=0.679，P<0.01)，而硬皮病患者皮損中無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：Smad3表達上調(diào)與Smad7下調(diào)可能促進了硬皮病纖維化的發(fā)展。

硬皮病( Scleroderma, SD)表現(xiàn)為局限性或彌漫性皮膚和內(nèi)臟器官膠原結(jié)締組織進行性纖維化硬化、萎縮為特點的一種結(jié)締組織疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor β， TGF-β)在SD發(fā)病中起重要作用，與纖維化關(guān)系密切，但具體作用機制尚未明確，可能與TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)途徑中各個環(huán)節(jié)異常有關(guān)。Smad3與Smad7是該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要分子，參與介導(dǎo)多種纖維化疾病的發(fā)生。本文通過免疫組織化學SP法檢測SD組織Smad3和Smad7蛋白的表達，探討其在SD發(fā)病中的作用。

材料和方法

1 材 料 ①標本：收集臨床和病理確診、未經(jīng)治療的SD皮膚標本共46例。以上標本來源于2009年2月至2012年6月西安交通大學第一附屬醫(yī)院皮膚科門診和住院SD患者。15例正常對照來源于同期我院整形外科及骨科手術(shù)切除的健康正常皮膚。正常對照組與SD患者性別、年齡無統(tǒng)計學差異。②試劑：兔抗人Smad3和Smad7多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物有限公司。

2 方 法 標本常規(guī)石蠟包埋制成連續(xù)5μm切片，采用免疫組化SP法進行染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸微波修復(fù)，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶；滴加正常山羊血清工作液室溫孵育20 min，滴加兔抗人Smad3和Smad7抗體(1∶100)，4℃過夜；滴加生物素標記山羊抗兔IgG工作液；滴加SP復(fù)合物；DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，脫水、透明，中性樹膠封片。每次實驗均設(shè)立陰性對照，實驗過程中用PBS緩沖液代替一抗做為陰性對照。

3 結(jié)果判定 結(jié)果判定標準根據(jù)Shimizu法[1]改良而成。在顯微鏡下(40×10倍)隨機選取5個視野(每個視野計數(shù)100個細胞)，按照陽性細胞所占百分比(陽性率)及染色強度分級評分。根據(jù)陽性率分為4級，陰性為0分，陽性率<20%為1分，20%～50%為2分，>50%為3分；根據(jù)染色強度分為3級：無著色為0分，淺著色為1分，深著色為2分；上述兩項積分相加：<2分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3分為陽性(++)，≥4分為強陽性(+++)。

4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗。兩變量之間相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Smad3和Smad7蛋白在SD組與對照組的表達 Smad3、Smad7蛋白在正常組織血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞及角質(zhì)形成細胞均有表達。Smad3在硬皮病組織中表達增強，而Smad7減弱(見附表)。

附表 Smad3、Smad7蛋白在SD組與對照組間的比較

注：Z值Mann-Whitney 檢驗，SD組與正常對照組比較

2 Smad3與Smad7蛋白表達的相關(guān)性分析 正常對照組皮膚中Smad3與Smad7蛋白范圍強度呈正相關(guān)(r=0.679，P<0.01)；而硬皮病患者皮損中Smad3與Smad7間無相關(guān)性(P>0.05)。

討 論

TGF-β在SD發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。Smad表達異常參與肺、肝及腎臟等器官纖維化過程已被研究證實。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能Smad被分為受體活化型，通用調(diào)節(jié)型和抑制型三種，其中Smad3屬于受體活化型，參與多種基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad7屬于抑制型Smad，組成TGF-β/Smad信號環(huán)路的負性調(diào)節(jié)信號。

Smad3增加不僅通過增加膠原的合成，而且通過減少金屬蛋白酶的降解和增加金屬蛋白酶抑制劑的合成促進纖維化的發(fā)生。許多纖維化動物模型的報道亦說明Smad3的丟失導(dǎo)致了纖維化反應(yīng)的減輕。Dong和李江濤、趙會平等[2～4]發(fā)現(xiàn)SD皮損中Smad3蛋白的表達升高，此外Mori等[5]在體外培養(yǎng)的SD成纖維細胞中亦證實Smad3蛋白水平增加。本研究顯示SD患者皮損中Smad3蛋白表達升高，得出與上述研究相類似的結(jié)果。這說明Smad3水平升高可能是導(dǎo)致TGF-β作用增強，膠原過度沉積及組織纖維化的重要因素。TGF-β可以誘導(dǎo)抑制型Smads的轉(zhuǎn)錄，表明抑制型Smads可以作為TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)自我調(diào)節(jié)的一種負反饋信號。Dong[2]在體外培養(yǎng)SD成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)水平及TGF-β誘導(dǎo)Smad7的表達能力明顯受損，而通過轉(zhuǎn)染Smad7恢復(fù)了SD成纖維細胞正常TGF-β信號，提示Smad7降低在TGF-β致纖維化中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)Smad7蛋白表達低于對照組，Smad7水平降低導(dǎo)致成纖維細胞在TGF-β刺激下過度活化。然而Asano[6]及國內(nèi)趙會平[4]報道SD皮損中Smad7是升高的，可能與其對TGF-β的抑制作用在SD中遭到了破壞有關(guān)。上述這些結(jié)果的差異有待于我們進一步研究。

正常情況下，細胞內(nèi)TGF-β/Smad信號激活在時間及空間上是緊密配對的，信號激活的同時伴隨有抑制信號的發(fā)生，即Smad3激活同時抑制型Smad7轉(zhuǎn)錄增加。本研究發(fā)現(xiàn)，正常對照組皮膚中Smad3與Smad7呈正相關(guān)，而硬皮病患者皮損中Smad3與Smad7間無相關(guān)性，二者間變化的不同步性打破了TGF-β環(huán)路的內(nèi)在平衡，這就為SD發(fā)病過程中成纖維細胞對TGF-β的高應(yīng)答性、信號的持續(xù)激活及表型的變化提供了基礎(chǔ)，這可能是SD纖維化不斷進展的重要因素。

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[2] Dong C, Zhu S, Wang T,etal. Deficient Smad7 expression: a putative molecular defect in scleroderma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(6): 3908-3913.

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[4] 趙會平, 肖 嶸, 羅勇奇，等. 硬皮病皮損中TGF-β1, Smad3和Smad7的檢測及意義[J]. 中國皮膚性病學雜志,2007, 21(4): 213-215.

[5] Mori Y, Chen SJ, Varga J,etal. Expression and regulation of intracellular Smad signaling in scleroderma skin fibroblasts[J]. Arthritis Rheum, 2003, 48(7): 1964-1978.

[6] Asano Y, Ihn H, Yamane K,etal. Impaired Smad7-Smurf-mediated negative regulation of TGF-beta signaling in scleroderma fibroblasts[J]. J Clin Invest, 2004, 113(2): 253-264.

(收稿：2015-05-20)

The expression and significance of Smad3 and Smad7 protein in skin lesions of patients with scleroderma Department of Dermatology, the First Affiliated Hospital, of Xi’an Jiao tong University

( Xi’an 710061)

Liu Wenli Zhang Jian Mu Xin et al

Objective: To investigate the roles of Smad3 and Smad7 protein in the pathogenesis of scleroderma. Methods: The expression of Smad3 and Smad7 in skin lesions from 46 patients with scleroderma and skin from 15 normal controls were detected with Immunohistochemistry SP assay. Results: Compared with controls, Smad3 protein in scleroderma lesions were increased (P<0.01), however, Smad7 were decreased (P<0.01). In normal tissues Smad3 was positive correlated with of Smad7(r=0.679，P<0.01). But there was no correlation in skin lesions of scleroderma(P>0.05). Conclusion: Smad3 up-regulation and Smad7 down-regulation maybe involve in the progression of fibrosis in scleroderma.

Scleroderma,Limited @Smad3 @Smad7

*陜西省科技攻關(guān)項目(2014K11-02-03-13)

硬皮病，局限性 @Smad3 @Smad7

R593

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.031

△通訊作者