西安市第九醫(yī)院(西安 710054)

高宇勤 郝霽萍? 劉美林 趙國(guó)平▲

芍藥苷預(yù)處理通過干預(yù)NF-κB信號(hào)通路對(duì)在體大鼠MIRI發(fā)揮保護(hù)作用*

西安市第九醫(yī)院(西安 710054)

高宇勤 郝霽萍?劉美林 趙國(guó)平▲

目的：探究芍藥苷預(yù)處理通過干預(yù)NF-κB信號(hào)通路對(duì)大鼠在體心肌缺血再灌注損傷的干預(yù)作用。方法：結(jié)扎SD大鼠心臟冠狀動(dòng)脈(LDA)建立在體MIRI模型，利用0.5 %Evan’s 藍(lán)灌注心肌及1 %TTC 磷酸緩沖液孵育心肌以觀察心肌壞死；Western blot探究芍藥苷預(yù)處理對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。結(jié)果：芍藥苷藥物預(yù)處理組(心梗面積0.13±0.04)與缺血再灌注組(0.360.06)比較，心梗面積明顯減小(P<0.01)；芍藥苷預(yù)處理抑制NF-κB蛋白的表達(dá)，能降低I-κB磷酸化，升高非磷酸化I-κB蛋白表達(dá)。結(jié)論：芍藥苷預(yù)處理降低大鼠在體MIRI模型的梗死面積、減輕炎癥表達(dá)，可能通過抑制NF-κB蛋白的表達(dá)，降低I-κB磷酸化，升高非磷酸化I-κB蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

目前研究認(rèn)為NF-κB 活化是心肌缺血再灌注早期眾多細(xì)胞因子表達(dá)的始動(dòng)因素,NF-κB轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)細(xì)胞因子如ICAM-1、TNFα等表達(dá)，進(jìn)而造成組織的炎癥損傷[1]。抑制NF-κB激活，有助于減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制急性炎癥反應(yīng)。所以研究藥物預(yù)處理干預(yù)此環(huán)節(jié)以求減輕心肌的MIRI是個(gè)研究熱點(diǎn)。芍藥苷對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用[2]。但是對(duì)于MIRI的研究較少，是否干預(yù)NF-κB信號(hào)通路，目前沒有相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)采用在體SD大鼠冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)結(jié)扎術(shù)建立模型來觀察芍藥苷預(yù)處理是否通過干預(yù)NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

材料和方法

1 試劑與儀器 芍藥苷購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥公司(批號(hào):ZL20090409SYG), NF-κB抗體，pI-κB(ser32/36)抗體，I-κB抗體購(gòu)自SANTA CRUZ公司; 其余皆為國(guó)產(chǎn)試劑。

2 動(dòng)物模型 SPF 級(jí)雄性SD(30只)大鼠，體重280～400g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002，2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉，行氣管插管，接呼吸機(jī)，呼吸頻率60次/min、通氣量20ml/kg?？v形剪開第三肋骨，鈍性分離胸腔，顯露心臟，確定縫扎位置(肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處下方2mm)。用0號(hào)線，疊一個(gè)0.8～1mm的凹槽硅膠管，結(jié)扎LAD，缺血30min后，復(fù)灌2h。模型復(fù)制的可靠性以ECGⅡ?qū)?lián)ST段抬高為心肌缺血存在，以ST段回落1/2為再灌注成功。本實(shí)驗(yàn)建模總共有4只SD大鼠因?yàn)槁樽砗褪中g(shù)原因死亡，死亡率13%。

3 分組及給藥方案 30只雄性SD大鼠被隨機(jī)分為3組,每組10只，3組分別為：假手術(shù)組(此組只開胸，但不結(jié)扎LAD)、缺血再灌注組、藥物預(yù)處理組。

藥物預(yù)處理組給予芍藥苷100mg/kg灌胃，1d/1次，連續(xù)4d，最后一次于手術(shù)前30min給予。其他兩組給予等量生理鹽水。

4 心肌梗死面積測(cè)定 原位結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈主干，經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注 0.5 %Evan’s 藍(lán) 2～3 ml , 立即取心臟，沖洗，將左室與其他心肌組織分離，快速置于液氮中，取出冷凍心臟，延左室長(zhǎng)軸方向連續(xù)環(huán)切，每片2～3mm，正常心肌為藍(lán)色，缺血心肌為粉色，將無藍(lán)染心肌置入1 %TTC中 37 ℃孵育20min ,壞死區(qū)呈灰白色 ,非壞死區(qū)呈深紅色 ,分離兩部分 ,濾紙吸干,稱重。梗死面積以壞死區(qū)重量與壞死區(qū)與非壞死區(qū)重量之和之比表示。

5 心肌組織HE染色 再灌注結(jié)束后，剪下心臟，洗凈，分離左心室前壁缺血區(qū)，切取3～5mm3組織，10%中性甲醛固定12h，脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、染色及中性樹膠封片，鏡下觀察。

6 蛋白印跡(Western blot)檢測(cè) 檢測(cè)NF-κB、I-κB蛋白，上液蛋白總量80μg，檢測(cè)pI-κB蛋白,上液蛋白量為120μg。轉(zhuǎn)膜條件：350 mA恒流濕轉(zhuǎn)45min。一抗孵育條件：anti-NF-κB(1∶1000)，anti-I-κB(1∶1000)，Anti-GAPDH(1∶2000), anti-pI-κB(1∶500)4 ℃ 孵育過夜，二抗(1∶5000)。用ECL 發(fā)光液，涂膜，蓋片，曝光，Quantity one軟件分析 Western blot 條帶的灰度值。

結(jié) 果

1 芍藥苷預(yù)處理對(duì)心肌梗死面積 本實(shí)驗(yàn)利用0.5 %Evan’s 藍(lán)灌注心肌及1 %TTC 磷酸緩沖液孵育心肌來觀察心肌壞死。芍藥苷預(yù)處理組與缺血再灌注組比較，心梗面積明顯減小(P<0.01)。

2 芍藥苷預(yù)處理對(duì)心肌組織病理的影響 HE染色觀察芍藥苷預(yù)處理對(duì)在體大鼠MIRI心肌病理形態(tài)的影響(見附圖)。缺血再灌注組大鼠心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)水腫，充血、出血，心肌橫紋不清或消失，細(xì)胞核腫脹甚至銷蝕、脫失，而芍藥苷預(yù)處理組的大鼠心肌損傷較缺血再灌注組心肌纖維結(jié)構(gòu)較輕，心肌間質(zhì)輕度水腫，部分核染色呈深染改變。組織病理學(xué)提示芍藥苷預(yù)處理可以減輕缺血再灌注損傷。

附圖 芍藥苷預(yù)處理對(duì)大鼠心肌組織病理的影響

3 芍藥苷預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷模型大鼠心肌NF-κB信號(hào)通路的影響 蛋白印跡(Western blot)觀察芍藥苷預(yù)處理對(duì)大鼠心肌NF-κB信號(hào)通路的影響。缺血再灌注組中，胞漿及胞核內(nèi)的NF-κB蛋白含量明顯高，而且磷酸化的pI-κB蛋白也明顯高，而非磷酸化I-κB明顯低，而芍藥苷預(yù)處理組的上述蛋白表達(dá)明顯相反，差別達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為(P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.01)。

討 論

NF-κB是一種具有基因轉(zhuǎn)錄多向調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，以失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。當(dāng)各種配體與受體結(jié)合后使I-κB磷酸化及pI-κB升高，隨后NF-κB活化后進(jìn)入細(xì)胞核，在核內(nèi)與靶基因的特異序列結(jié)合并動(dòng)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞因子如ICAM-1、TNFα等的生成，造成內(nèi)皮、心肌細(xì)胞的損傷以及炎癥損傷[3]。通過下調(diào)心肌組織NF-κB和pI-κB，升高I-κB的表達(dá)，可以減少心肌炎癥反應(yīng)及組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷[4]可降低BAX及Caspase-3的表達(dá)，上調(diào)BCL-2的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡及心肌梗死面積，但是對(duì)于NF-κB信號(hào)通路的影響，缺乏文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)利用0.5 %Evan’s 藍(lán)灌注及1 %TTC 孵育心肌，發(fā)現(xiàn)芍藥苷能減少大鼠MIRI模型的心梗面積，同文獻(xiàn)報(bào)道相符[4]；組織病理學(xué)觀察也應(yīng)證了芍藥苷預(yù)處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷程度。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芍藥苷預(yù)處理能抑制胞漿內(nèi)的NF-κB蛋白的表達(dá)，并減少細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白含量，同時(shí)芍藥苷預(yù)處理增加非磷酸化I-κB蛋白表達(dá)，減少磷酸化pI-κB蛋白表達(dá)，證明芍藥苷預(yù)處理通過抑制NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

[1] Lu M, Tang F, Zhang J,etal.Astragaloside IV attenuates injury caused by myocardial ischemia/reperfusion in rats via regulation of toll-like receptor 4/nuclear factor-κB signaling pathway[J].Phytother Res,2015,29(4):599-606.

[2] Xiaofei Li, Zhibin Wen, Xiaofan He,etal. Effects of Cinnamic Acidon Expression of Tissue Factor Induced by TNFα in Endothelial Cells and its Mechanisms[J]. J Chin Med Assoc,2006,69(5):207-212.

[3] Yuan X, Niu HT, Wang PL,etal.Cardioprotective Effect of Licochalcone D against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Langendorff-Perfused Rat Hearts[J].PLoS One. 2015,10(6):e0128375.

[4] Nizamutdinova IT, Jin YC,Kim JS, Yean MH,etal. Paeonol and paeoniflorin, the main active principles of Paeonia albiflora, protect the heart from myocardial ischemia/reperfusion injury inrats[J]. Planta Med,2008,74(1):576-584.

(收稿：2015-07-15)

*國(guó)家自然科學(xué)基金(81173189)

心肌缺血/并發(fā)癥 再灌注損傷 NF-κB @芍藥苷

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.005

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西安科技項(xiàng)目(SF1416)

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