陜西省人民醫(yī)院心血管內二科(西安710068)

程 功 陳春燕△ 壽錫凌 韓新源▲

·論著·基礎研究·

卡托普利對自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈縫隙連接蛋白43表達的影響*

陜西省人民醫(yī)院心血管內二科(西安710068)

程 功 陳春燕△壽錫凌 韓新源▲

目的：通過比較Cx43在正常大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈表達的差異, 以及經卡托普利干預后的變化, 來闡明卡托普利抗高血壓血管重構的分子機制。方法：12周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)16只隨機分為對照組和卡托普利干預組,以年齡和體重匹配的Wistar-Kyoto大鼠(WKYs)為正?？瞻讓φ战M。干預組，灌胃法給予卡托普利[12.5mg·d)]，8周后，采用無創(chuàng)血壓測定儀測量3組大鼠尾動脈收縮壓；用酶聯免疫吸附法測量血漿和胸主動脈組織血管緊張素Ⅱ(AngII)濃度。采用實時定量RT-PCR和Western blot分析，檢測3組大鼠胸主動脈組織內Cx43的mRNA及蛋白表達。結果：SHR組的血漿、動脈組織AngII濃度較WKY大鼠組明顯升高，而卡托普利干預組的血漿、組織AngII濃度則較SHR組明顯降低。SHR組胸主動脈的Cx43的mRNA表達高于WKY組(P<0.01), 卡托普利降低Cx43mRNA的表達(P<0.01)。蛋白印跡法顯示，SHR組大鼠胸主動脈中,Cx43蛋白表達高于WKY大鼠組(P<0.01)?？ㄍ衅绽档徒M織主動脈內Cx43的蛋白表達(P<0.01)。結論：自發(fā)性高血壓大鼠主動脈Cx43表達增強, 卡托普利能夠降低胸主動脈Cx43的表達。

縫隙連接(Gap junction，GJ)作為細胞間的直接通訊方式是由縫隙連接蛋白(Connexin，Cx)家族組成[1]。已有研究表明，GJ在調節(jié)血管舒縮以及血管平滑肌細胞增殖、表型轉變中發(fā)揮重要作用，并與高血壓的形成和發(fā)展密切相關[2]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin angiotensin system, RAS)作為一類重要的生物活性物質，廣泛存在于心臟、血管、腎臟等多種組織中，RAS系統(tǒng)的過度激活則是高血壓發(fā)病機制之一[3]。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, AngⅡ)作為RAS系統(tǒng)循環(huán)和局部主要的效應分子，在高血壓的發(fā)展和維持上起著重要作用。血管緊張素轉換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)是目前臨床上最常用的降壓藥物之一。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHRs)為模型，觀察經卡托普利干預后SHR胸主動脈Cx43表達的變化, 旨在探討卡托普利抗高血壓的分子機制。

材料與方法

1 實驗動物分組與處理 12周齡雄性SHR大鼠16只(購自西安交通大學醫(yī)學院動物中心)隨機分為2組：空白對照組(SHR組)和卡托普利組(SHR+Capt)，每組8只。再選取周齡、體重匹配的雄性Wistar大鼠(均購于購自西安交通大學醫(yī)學院動物中心)8只(WKY組)作為正常對照組。將卡托普利(商品名:開博通, 百時美施貴寶公司生產)研碎后溶于蒸餾水中制成懸液，按照12.5mg/(kg·d)的劑量灌胃給藥，給藥其間根據體重增長情況調整給藥量劑量?？瞻讓φ战M和正常對照組則給予生理鹽水灌胃，均喂養(yǎng)8周。

2 血壓測量 分別于給藥前及給藥后第8周采用用無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)測量大鼠安靜清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓( Systolic blood pressure, SBP)。連續(xù)測量3次,取其平均值。

3 血管緊張素Ⅱ的測定 分別測取胸主動脈和血漿中的AngⅡ含量，方法如下：①血液血管緊張素Ⅱ(AngII)測定：血壓測量結束后，穿刺右室，采血2.5 ml放入預先準備的EDTA抗凝管中，搖勻，4℃ 3000 rpm離心10 min，分離血漿，放入-80℃冰箱保存待測。②心房組織AngII測定：血液標本采集完畢后，頸椎脫臼法處死大鼠，迅速開胸游離胸主動脈，留取部分組織液氮冷凍，用于后續(xù)實驗。剩余部分用分析天平稱重，冰生理鹽水洗凈，加1 ml預冷的0．9%NaCl溶液中冰浴勻漿，加入蛋白酶抑制劑，95℃水浴中加熱10 min，4℃ 10000r/min離心2次，取上清液﹣80℃保存待測。AngⅡ濃度采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測，測定方法按照試劑盒說明的操作步驟進行。

4 Real-time PCR法檢測各組大鼠胸主動脈Cx43的基因表達 按照Fast200試劑盒說明書，提取胸主動脈總RNA，核算定量儀測定所抽提RNA的濃度以及OD260/280值，OD260/280值在1.8～2.0則視為純度很高，可以進行下一步操作。按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明進行反轉錄反應，反應條件為37℃ 15 min( 反轉錄反應)，85℃ 5 S(反轉錄酶的失活反應)合成cDNA。以 NCBI Gen Bank提供的GAPDH、Cx43的cDNA序列為模板，由北京奧科生物科技公司合成引物。引物序列如下： Cx43：上游：5’- TTGTTTCTGTCACCAGTAAC -3’；下游：5’- GATGAGGAAGGAAGAGAAGC -3’； GAPDH：上游：5’-GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT-3’；下游：5’-TGCCGAAGTGGTCGTGGATGACCT-3’。按照TaKaRa Real-time PCR 試劑盒操作說明進行反應， 采用三步法PCR擴增程序，第一步95℃3min，第二步PCR反應95℃10s，59℃30s，72℃30s，40個循環(huán)，第三步55℃10s，81個循環(huán)。擴增曲線完成后自動生成融解曲線，反應完成后確認擴增曲線和融解曲線。根據Bio-Rad iQ5 Real-time PCR儀軟件得出的各個樣本的CT值，按照2-△△Ct法計算各個基因的相對表達量；用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物，只有單一的擴增條帶，未見引物二聚體等非特異性條帶,說明擴增反應是特異的。

5 Western blot測定各組大鼠胸主動脈Cx43的蛋白表達 提取動脈組織總蛋白并用BCA法測定蛋白濃度，按每泳道加總蛋白20μg 用10%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，電泳后用半干轉印法110V，2h轉移至PVDF膜上，用5%TBST奶室溫封閉1小時后加入1∶1000稀釋的Cx43一抗(Abcam，英國)、GAPDH(1∶1000稀釋)，4℃孵育過夜。用TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1h，與增強化學發(fā)光試劑(ECL)(A：B=1∶1)于暗處反應5min，后利用Chemidoc化學發(fā)光儀顯影成像，以BIO-RAD公司的Quantity One成像分析系統(tǒng)進行WB條帶的灰度值分析。以目的蛋白與內參蛋白GAPDH比值作為目的蛋白的相對表達量。

結 果

1 各組大鼠血壓比較 3組大鼠尾動脈血壓顯示，給藥前, SHR對照組和卡托普利組收縮壓均顯著高于WKY組(均P<0.01) 。給藥結束后, SHR組平均動脈壓較Wistar組仍顯著升高；而卡托普利干預組平均動脈壓較高血壓組顯著降低(P<0.01)，但和Wistar組無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2 各組大鼠血漿及組織Ang II濃度比較 SHR組大鼠血漿、組織Ang II濃度較WKY組明顯升高(P<0.01,P<0.001)，卡托普利干預組血漿及組織勻漿Ang II濃度較SHR組明顯降低(P<0.01,P<0.001)，見表2。

表1 各組大鼠干預前后血壓的比較

注：與WKY組比較*P<0.01；與SHR比較#P<0.01

表2 各組大鼠血漿及組織Ang II濃度比較

注：與WKY組比較*P<0.01，**P<0.001；與SHR比較#P<0.01，##P<0.001

3 卡托普利對大鼠胸主動脈Cx43mRNA表達的影響 SHR對照組胸主動脈Cx43 mRNA的表達為WKY組的1.57倍(P<0.01)，而卡托普利干預組Cx43 mRNA的表達則較SHR對照組明顯降低(P<0.01)，且卡托普利干預組與WKY組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.01)。

4 卡托普利對大鼠胸主動脈Cx43蛋白表達的影響 SHR對照組胸主動脈Cx43蛋白表達高于WKY組79%(P<0.0.1)，而卡托普利干預組的Cx43蛋白表達量則低于SHR對照組的74%(P<0.01)。

討 論

縫隙連接通道的基本組成單位是連接蛋白，由6個Cx圍成，小體中央形成直徑1. 5 nm 的親水管道，即為Cx 半通道。相鄰細胞間的Cx 半通道對接而組成完整GJ 通道[4]。在心血管系統(tǒng)，縫隙連接通道是心肌細胞、血管的內皮細胞、平滑肌細胞間通訊的結構基礎。在血管組織，縫隙連接通道間傳導的信號能夠協調血管的收縮和舒張。血管是一個三層的組織結構主要由內膜的內皮細胞、中膜的平滑肌細胞和外模的成纖維細胞構成，內皮細胞主要表達Cx37、Cx40和少量Cx43，而平滑肌細胞則主要表達Cx43、Cx45及少量的Cx37和Cx40[5]。血管壁重構導致內皮細胞和平滑肌細胞機械應力的變化能夠影響Cx的表達。

國內外的研究已證實，無論是自發(fā)性高血壓大鼠還是腎性高血壓大鼠主動脈的Cx43表達均發(fā)生了改變，但這些研究結果并非完全一致。對于SHR大鼠，有研究認為主動脈Cx43的表達升高，但也有研究認為Cx43的表達則是下降的；而在腸系膜動脈，Cx43的mRNA水平則在自發(fā)性高血壓大鼠與正常血壓大鼠間無明顯差異[6，7]。但是對于腎性高血壓，大多數研究認為Cx43的表達升高。本研究選取自發(fā)性高血壓大鼠，通過觀察其胸主動脈Cx43的表達，發(fā)現自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈Cx43的表達相對正常血壓大鼠明顯上升，這與既往的研究結果相符。

RAS的激活在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，尤其是組織局部存在的RAS更是在神經-體液調節(jié)機制中發(fā)揮著重要的作用。本實驗觀察到自發(fā)性高血壓大鼠血漿AngⅡ含量較WKY大鼠組明顯升高，而在血管組織中AngⅡ的含量也較WKY組高?？ㄍ衅绽麨榕R床上常用的ACEI制劑，本研究中卡托普利的使用，同時降低了血漿和血管組織AngⅡ含量，但對血管組織的效應遠遠大于對血漿AngⅡ含量的影響。這一結果進一步說明了組織局部RAS系統(tǒng)的激活，在高血壓發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的調控作用。

Alonso等研究發(fā)現AngⅡ能濃度依賴性增加動脈平滑肌細胞Cx43蛋白的表達, 而該效應與ERK和NF-kB通路的激活有關。本研究報道大鼠胸主動脈Cx43較正常高血壓大鼠表達增高, 而卡托普利能降低大鼠動脈Cx43的表達。卡托普利的這一作用可能是通過降低血管組織AngⅡ的濃度，從而影響了動脈平滑肌細胞Cx43的表達。此研究為ACEI類藥物在高血壓的治療提供了新的理論依據。

[1] Evans WH, Martin PE. Gap junctions: structure and function[J]. Mol Membr Biol, 2002, 19(2):121-136.

[2] Haefliger JA, Nicod P, Meda P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall[J]. Cardiovasc Res 2004，62:345-56.

[3] Schmieder RE, Hilgers KF, Schlaich MP,etal. Renin-angiotensin system and cardiovascular risk. Lancet[J]. 2007，369:1208 -1219.

[4] Sohl G，Willecke K． Gap junctions and the connexin protein family[J]．Cardiovasc Res，2004，62( 2):228-232.

[5] Figueroa XF, Duling BR. Gap junctions in the control of vascular function[J]. Antioxid Redox Signal，2009，11:251-266.

[6] Rummery NM, McKenzie KU, Whitworth JA,etal.Decreased endothelial size and connexin expression in rat caudal arteries during hypertension[J]. J Hypertens, 2002,20(2): 247-253.

[7] Rummery NM, Grayson TH, Hill CE. Angiotensin-converting enzyme inhibition restores endothelial but not medial connexin expression in hypertensive rats[J]. J Hypertens,2005, 23(2): 317-328.

(收稿：2015-07-15)

Effects of captopril on the expression of connexin 43 in thoracic aorta from spontaneous hypertensive rats Second Department of Cardiology, Shaanxi Provincial People’s Hospital

( Xi’an 710068)

Cheng Gong Chen Chunyan Shou XiLing et al

Objective:To investigate the differential expression of connexin 43 in thoracic aorta between spontaneously hypertensive rats(SHRs)and Wistar-Kyoto rats(WKYs),and effects of captopril on the expression of Cx43 in thoracic aorta of SHR and possible underlying mechanism.Methods:Sixteen 12-weeks old male SHRs were randomly divided into two groups：SHR control group receiving placebo and captopril group receiving captopril 12.5mg/(kg·d).Another eight WKY rats served as blank control group.Before and after eight weeks treatment, rats arterial pressure of tail were measured.When the treatment finished, plasma angiotensin II level and thoracic aortic tissue angiotensin II level were measured with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method.Moreover,Cx43 mRNA and protein levels in thoracic aortic tissue were determined by RT-PCR and Western blot.Results: The plasma and thoracic aortic tissue angiotensin II levels were significantly increased in SHR as compared with the WKY group and captopril reduced the plasma and thoracic aortic tissue angiotensin II as compared with the SHR group(P<0.01).The expression of Cx43 mRNA in thoracic aorta of SHR group was obviously higher than that in the WKY rats(P<0.01)and was markedly decreased by captopril treatment(P<0.01).Cx43 protein level was higher as compared with that in WKY rats(P<0.01).Treatment with captopril significantly down-regulated Cx43 protein expression(P<0.01).Conclusion: The expression of Cx43 up-regulated in thoracic aorta of SHR and captopril treatment can ameliorate Cx43 increasing in thoracic aorta of SHR.

Angiotensin Ⅱ Captopril Connexins Animals,laboratory Rat

*陜西省自然科學基金(2013JC2-16)

血管緊張素II 卡托普利 連接蛋白類 動物，實驗 大鼠

R544.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.001

△西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內科

▲通訊作者