王郁金 周永學(xué)△ 張 紅 閆曙光 滿思藝 謝 培 李 莎

成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都610075)

硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠腸道水液代謝的影響*

王郁金▲周永學(xué)△▲張 紅▲閆曙光▲滿思藝▲謝 培▲李 莎▲

成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都610075)

目的：探討硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠腸道水液代謝的影響 。方法：成年SD雄性大鼠50只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、硝菔通結(jié)方高、中、低劑量組各10只。采用復(fù)方地芬諾酯灌胃建立SD大鼠功能性便秘模型，造模成功后各治療組分別給予不同劑量硝菔通結(jié)方灌胃3周。觀察各組大鼠首粒黑便的排出時(shí)間、糞便含水率、結(jié)腸含水率、免疫組化檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織中VIP及AQP3的表達(dá)。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠糞便量少、質(zhì)地干硬,首粒黑便排出時(shí)間明顯延長(zhǎng)，糞便含水率和結(jié)腸含水率減少，結(jié)腸組織中VIP表達(dá)降低、AQP3的表達(dá)升高。與模型組比較，硝菔通結(jié)方各劑量組大鼠糞便量增加，質(zhì)地稀軟，首粒黑便時(shí)間縮短，大便含水率增多，結(jié)腸含水率增多，結(jié)腸組織中VIP表達(dá)升高，AQP3的表達(dá)降低。結(jié)論：大鼠功能性便秘的發(fā)生與腸道水液代謝障礙有關(guān)，硝菔通結(jié)方可通過調(diào)節(jié)腸道水液代謝治療功能性便秘。

功能性便秘是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病，罹患人數(shù)逐年增加，雖然一般不直接危及生命,但給患者生活上帶來極大的不便,并且可以誘發(fā)或加重其它疾病(如高血壓、冠心病、心力衰竭等),甚至導(dǎo)致患者致殘或死亡。所以隨著人們對(duì)生活質(zhì)量的逐步重視, 提高便秘的治療效果已成為一個(gè)迫切的臨床課題。近年來，中醫(yī)藥治療便秘，取得了良好的療效，但許多藥物含有蒽醌類成分，不宜長(zhǎng)期服用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘療效確切，且該方不含蒽醌類成分。因此我們進(jìn)一步觀察該方對(duì)功能性便秘大鼠首粒黑便的排出時(shí)間、糞便含水率、結(jié)腸含水率、結(jié)腸組織中VIP及AQP3的表達(dá)，明確其治療功能性便秘的作用機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材 料 1.1 動(dòng) 物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，50只，體重200±20g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(陜)2012-003。

1.2 藥物及制備 硝菔通結(jié)方(肉蓯蓉Cistanche deserticola Ma15g、當(dāng)歸Angelica sinensis15g、芒硝Natrii Sulfas30g、鮮萊菔Raphanus sativus L1000g)，上述中藥飲片購于陜西省咸陽市百姓樂大藥房，并經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室鑒定；以上藥物鮮萊菔切片，分兩次同芒硝水煎，得濃汁，入肉蓯蓉、當(dāng)歸同煎，并濃縮至56mL(19g·mL-1)，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?fù)方地芬諾酯片：江蘇常州康普藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑與儀器 免疫組化染色試劑盒，購于武漢博士德生物工程有限公司；水合氯醛：上海山浦化工有限公司，生產(chǎn)日期：2012年11月10日；金屬恒溫加熱器，生產(chǎn)序號(hào)：BC890301，上海博彩生物技術(shù)有限公司；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)：TC-120型，產(chǎn)品型號(hào)：S時(shí)代先鋒型，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司；生物組織包埋機(jī)：TB-718E型；湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司； 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科技儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 動(dòng)物分組 SD雄性大鼠50只，體重200±20g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、硝菔通結(jié)方高(380g·kg-1)、中(190g·kg-1)、低(95g·kg-1)劑量組各10只。

2.2 功能性便秘大鼠模型的建立 動(dòng)物禁食不禁水16h后，以10mL·kg-1體積(15mg·kgmL-1濃度)給予復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃，每天1次，當(dāng)大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)差，進(jìn)食減少，體重減輕，大便粒型小、干硬等表現(xiàn)時(shí)，為造模成功。

2.3 給藥方法 造模成功的模型大鼠，按照以下分組進(jìn)行硝菔通結(jié)方治療?？瞻捉M和模型組正常飼養(yǎng)，以0.9%NaCl灌胃；中藥低中高劑量組分別以不同濃度的硝菔通結(jié)方水煎劑予以灌胃，共灌胃藥3周。

2.4 指標(biāo)的檢測(cè) 2.4.1 一般行為學(xué)觀察：每日觀察動(dòng)物一般行為表現(xiàn)及排便情況。

2.4.2 首粒黑便、糞便含水率、結(jié)腸含水率觀測(cè)：采用活性炭灌胃法測(cè)定首粒黑便時(shí)間，觀察腸道傳輸功能，硝菔通結(jié)方治療后，每組隨機(jī)挑取5只大鼠，單只放于大鼠代謝籠內(nèi)，禁食16h后，經(jīng)口灌入100g/L活性炭混懸液2mL，從活性炭灌胃完畢開始記錄大鼠第一粒黑便排出時(shí)間。給藥結(jié)束后，將大鼠放于代謝籠，收集24h糞便，稱其濕重，糞便60℃恒溫干燥箱，稱其干重，計(jì)算糞便含水率。糞便含水率=(濕重-干重)/濕重×100%。給藥結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食不禁水24h，10%的水合氯醛 4mL/kg腹腔注射麻醉，取肛門上方部位結(jié)腸組織2cm，用預(yù)冷的生理鹽水清洗，稱取濕重，置于60℃恒溫干燥箱干燥，稱其干重，計(jì)算結(jié)腸含水率。結(jié)腸含水率=(濕重-干重)/濕重*100%。

2.4.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織中VIP、AQP3的表達(dá)：給藥結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食不禁水24h，10%的水合氯醛 4mL/kg腹腔注射麻醉，取回盲部以下結(jié)腸組織浸入10%中性甲醛固液固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，4μm切片，脫蠟脫水，3%H2O2室溫孵育5～10min，蒸餾水沖洗,PBS浸泡5 min x2，5-10%山羊血清封閉,室溫孵育10min，一抗4℃過夜,二抗37℃ 孵10～30 min,滴加適量辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液,37℃孵育10～30min,顯色劑顯色3～15min，沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 一般行為表現(xiàn) 復(fù)方地芬諾酯灌胃造模28天后，各造模組大鼠精神狀態(tài)差，被毛脫落,活動(dòng)減少，大便量少干硬，粒型小，空白組大鼠精神狀態(tài)良好、二便正常，造模成功。硝菔通結(jié)方治療后，各給藥組大鼠上述癥狀逐漸減輕并恢復(fù)，尤以高中劑量組效果最為明顯。

3.2 硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠首粒黑便排出時(shí)間、糞便含水率、結(jié)腸含水率的影響 與空白組比較，模型組大鼠首次黑現(xiàn)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，糞便含水率減少(P<0.05)，結(jié)腸含水率明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，硝菔通結(jié)方各劑量組大鼠首粒黑便排出時(shí)間均明顯縮短(P<0.01)，糞便含水率高劑量組明顯增多(P<0.01)，中劑量組也增多(P<0.05)，低劑量組無顯著性差異，結(jié)腸含水率高劑量組明顯增多(P<0.01)，中劑量組和低劑量組也增多(P<0.05)， 見表1。

表1 硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠首粒黑便排除時(shí)間、糞便含水率、結(jié)腸含水率的影響

組 別劑量/g·kg?1首粒黑便排除時(shí)間/min糞便含水率(%)結(jié)腸含水率(%)空白組?177．66±21．5051．44±6．2575．68±6．63模型組?287．69±25．99◆43．27±5．34◇68．56±7．91◆硝菔通結(jié)方大劑量組380169．45±23．99△54．03±9．35△79．16±7．52△硝菔通結(jié)方中劑量組190184．24±13．43△49．16±5．92▲76．34±6．78▲硝菔通結(jié)方小劑量組95206．74±38．49△45．24±8．5573．38±5．39▲

注：與空白組比較◇P<0.05，◆P<0.01；與模型組比較▲P<0.05，△P<0.01

3.3 硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠結(jié)腸組織中VIP、AQP3免疫組化染色半定量分析 免疫組化染色結(jié)果顯示：VIP陽性細(xì)胞核著色為主，AQP3陽性反應(yīng)細(xì)胞主要以胞漿和胞膜著色為主，呈棕黃色，胞核為藍(lán)色。棕黃色即為陽性信號(hào)，在40×視野下，每組隨機(jī)取12個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取均值。各組大鼠結(jié)腸免疫組化染色半定量分析差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果詳見表2 ，圖1-10。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織中VIP、AQP3免疫組化染色半定量分析 ( n =12)

注：與空白組比較◆P<0.01；與模型組比較▲P<0.05，△P<0.01

4 討 論 祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為便秘的基本病變屬大腸傳導(dǎo)失常，與臟腑功能失調(diào)密切相關(guān)。尤其是老年性便秘多以腎虛精虧為本，腑實(shí)燥結(jié)為標(biāo)[1-2]?！吨T病源候論》云: “……腎臟受邪，虛而不能制小便，則小便利，津液枯燥，腸胃干澀，故大便難。”因此我們參考《景岳全書》濟(jì)川煎的組方，在張錫純硝菔通結(jié)湯基礎(chǔ)上加入肉蓯蓉、當(dāng)歸，創(chuàng)立了硝菔通結(jié)方(肉蓯蓉、當(dāng)歸、芒硝、萊菔)，該方溫腎益精養(yǎng)血，軟堅(jiān)潤(rùn)腸通便，對(duì)功能性便秘標(biāo)本兼治。方中芒硝咸寒泄熱，軟堅(jiān)潤(rùn)腸通便，現(xiàn)代研究芒硝可顯著增加小腸水分含量、稀釋糞便，促進(jìn)瀉下，芒硝溶化或煎汁內(nèi)服后，其硫酸鈉的硫酸根離子被腸黏膜吸收，在腸道內(nèi)形成高滲鹽溶液，吸附大量水分，使腸道擴(kuò)張，引起機(jī)械刺激，促進(jìn)腸蠕動(dòng)，從而發(fā)生排便效應(yīng)。萊菔消食行滯，降氣通便，文獻(xiàn)報(bào)道萊菔子水煎劑可增強(qiáng)豚鼠體外胃竇環(huán)行肌條的收縮活動(dòng)[3]； 萊菔子正己烷提取物有促進(jìn)小鼠胃腸排空的作用；肉蓯蓉溫腎益精，潤(rùn)腸通便，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉類藥物的水煎劑具有明顯的通便作用，可改善腸蠕動(dòng)，抑制大腸的水分吸收，縮短排便時(shí)間[4]。當(dāng)歸歸肝心脾經(jīng)，性辛溫，具有行走之性，功效補(bǔ)血活血，潤(rùn)腸通便。四藥合用從而使腸道滋潤(rùn)，大便軟化，促進(jìn)排出。

功能性便秘與腸道水液代謝密切相關(guān)， VIP與AQP3是反映腸道水液代謝的相關(guān)指標(biāo)[5]。VIP是腸神經(jīng)系統(tǒng)中最具代表性和研究得最深入的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)有重要的調(diào)節(jié)作用，其受體廣泛分布于人和動(dòng)物的多種組織器官上。VIP 作為一種多效性作用的神經(jīng)遞質(zhì)，具有擴(kuò)張血管、降低血壓的作用，對(duì)腸液的分泌具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，對(duì)胃液的分泌可起抑制作用，對(duì)消化道平滑肌的收縮產(chǎn)生抑制作用[6]。AQP3屬跨膜蛋白家族，主要分布于人類小腸和結(jié)腸的上皮細(xì)胞中，其所介導(dǎo)的自由水快速被動(dòng)的跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)是水進(jìn)出細(xì)胞的主要途徑，在消化道上皮細(xì)胞對(duì)水的吸收中起重要作用[7]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明功能性便秘大鼠首粒黑便排出時(shí)間明顯延長(zhǎng)，糞便含水率、結(jié)腸含水率明顯減少，結(jié)腸組織中VIP表達(dá)明顯減少、AQP3表達(dá)明顯增多，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相一致。硝菔通結(jié)方治療組，便秘大鼠的便秘癥狀明顯改善，首粒黑便排出時(shí)間縮短，糞便含水率、結(jié)腸含水率明顯升高，同時(shí)大鼠結(jié)腸組織中VIP表達(dá)增多，AQP3表達(dá)減少。提示硝菔通結(jié)方治療功能性便秘的作用機(jī)制可能是通調(diào)節(jié)腸道水液代謝來實(shí)現(xiàn)。

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(收稿2014-06-11；修回2014-07-25)

*國(guó)家自然科學(xué)基金(81273663)

@硝菔通結(jié)方 功能性便秘 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 大鼠

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.056

國(guó)家課題重大專項(xiàng)(2012ZX09103201-037)

▲陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽 712046)

△通訊作者:陜西省胃腸病證方藥重點(diǎn)研究室(咸陽 712046)