谷 風(fēng) 陶紅星 沈祖泓 曾遠(yuǎn)強(qiáng) 羅彩萍 張敏玲 苗久旺

廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬清遠(yuǎn)中醫(yī)院(清遠(yuǎn) 511500)

澤丹沖劑對(duì)盆腔炎性大鼠子宮TGF-β1、Smad3的影響研究*

谷 風(fēng) 陶紅星△沈祖泓 曾遠(yuǎn)強(qiáng) 羅彩萍 張敏玲 苗久旺▲

廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬清遠(yuǎn)中醫(yī)院(清遠(yuǎn) 511500)

目的：研究澤丹沖劑對(duì)慢性盆腔炎大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3表達(dá)的影響，闡明以利濕化瘀法為主的澤丹沖劑作用機(jī)制。方法：大鼠雙側(cè)宮腔內(nèi)注射大腸桿菌混懸液(濃度約為6×106)0.2mL建立慢性盆腔炎大鼠模型。造模成功后，隨機(jī)分成澤丹沖劑高、中(8g·kg、4g·kg)劑量組，婦樂(lè)顆粒組(2.5 g·kg)，模型組和正常組。灌胃給藥21d后，采用Western Blot法檢測(cè)大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，澤中、高劑量組，婦樂(lè)組子宮組織TGF-β1、Smad3表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，但澤中、高劑量組優(yōu)于婦樂(lè)組(P<0.05)。結(jié)論：澤丹沖劑通過(guò)降低TGF-β1、Smad3的異常高表達(dá)，減輕慢性盆腔炎大鼠子宮組織的纖維化及粘連，因而對(duì)慢性盆腔炎具有良好的治療作用。

慢性盆腔炎易反復(fù)發(fā)作，遷延致包塊形成、不孕、月經(jīng)不調(diào)等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。前期的臨床研究及部分實(shí)驗(yàn)研究表明[2-5]，以利濕化瘀法為的澤丹沖劑可調(diào)節(jié)慢性盆腔炎患者血清-CRP、SOD、MDA等異常表達(dá)，具有良好的臨床療效及抗組織氧化、改善局部血液循環(huán)等作用，因此，本研究旨在前期基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討澤丹沖劑對(duì)慢性盆腔炎大鼠模型治療作用的影響，以期為臨床研究及新藥的開(kāi)發(fā)研制進(jìn)一步提供更多的、更深層次的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料 SD雌性大鼠55只、SPF級(jí)，體重(200±20)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 [許可證號(hào)SYKK(粵)2008-0092]。澤丹沖劑由澤瀉、桃仁、丹參、當(dāng)歸等組成，上述藥物按處方量投料，加10倍水煎煮，每次3h，共2次，煎煮液合并后，濃縮、真空干燥，得干浸膏備用(由清遠(yuǎn)市中醫(yī)院制劑室提供)；婦樂(lè)顆粒(江西南昌濟(jì)生制藥廠生產(chǎn)，每袋6g)，用蒸餾水配成0.13mg/mL混懸液，40C下保存，使用時(shí)充分搖勻[6]。

1.2 方 法

1.2.1 造模方法：用濃度為10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3mL/100g)，無(wú)菌條件下取大鼠下腹正中切口約0.8～1.0cm，暴露子宮，用4號(hào)針頭分別向雙側(cè)宮腔內(nèi)注射大腸桿菌混懸液(濃度約為6×106)0.2mL，注畢，分層關(guān)腹，消毒術(shù)區(qū)，正常喂養(yǎng)[6]。

1.2.2 分組及處理：SD雌性大鼠55只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只為正常組，其余45只造模后隨機(jī)分為模型組(15只、其中隨機(jī)抽取5只做模型驗(yàn)證)、澤丹沖劑高劑量組(澤高組)(10只)、澤丹沖劑中劑量組(澤中組)(10只)、婦樂(lè)顆粒組(婦樂(lè)組)(10只)。造模成功后，第8d開(kāi)始灌胃給藥，藥物劑量按照人與動(dòng)物公斤體重的等效劑量比值進(jìn)行折算給藥[7]。澤高組、澤中組予澤丹沖劑(8g·kg、4g·kg)，婦樂(lè)組予婦樂(lè)顆?；鞈乙?2.5 g·kg)，正常組和模型組予等體積生理鹽水，1d1次 ，連續(xù) 21d[5]。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)：給藥后第22d早上禁食，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠子宮組織，采用Western blot法檢測(cè)子宮組織TGF-β1、Smad3的表達(dá)。

1.2.4 病理判定標(biāo)準(zhǔn)[8-9]：無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，為0分(+)；內(nèi)膜中見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，為1分(++)；內(nèi)膜中見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且腺上皮輕度增生、極性排列規(guī)則，為2分(+++)。采用雙盲法，每張切片由兩位病理醫(yī)師分別記分。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠子宮組織病理變化 2.1.1大體觀察：正常組：子宮大小、形態(tài)正常，漿膜無(wú)明顯充血及水腫，與盆腔周圍組織無(wú)粘連；模型組：子宮明顯腫脹、粘膜充血及水腫，多數(shù)宮腔迂曲腫脹，末端球狀膨大，切面管壁變薄，管腔內(nèi)可見(jiàn)清亮液體；澤高組：子宮無(wú)明顯充血，與盆腔組織粘連明顯減輕，少數(shù)有輕度積液；澤中組：子宮腫脹、充血基本消失，無(wú)積液，與盆腔周圍組織粘連顯著減輕；婦樂(lè)組：子宮炎性充血部分消失，與周圍組織輕度粘連，子宮形態(tài)部分恢復(fù)正常[6]。

2.1.2子宮組織HE染色病理評(píng)分：與模型組比較，澤中、高組，婦樂(lè)組子宮組織病理評(píng)分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中澤中組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示澤中、高組均能減輕大鼠子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕充血及腫脹[6](見(jiàn)表1)。

表1 慢性盆腔炎大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)的改變

注：與模型組相比，△P<0.05，▲P<0.01

2.1.3 各組大鼠子宮組織含TGF-β1、Smad3的表達(dá)(見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3的表達(dá)結(jié)果±s)

注：與模型組比較，△P<0.05；與澤中組比較，◇P<0.05

結(jié)果顯示：模型組TGF-β1表達(dá)顯著高于其它各組(P<0.05)；澤中組與正常組比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；婦樂(lè)組與澤高組比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與澤中組比較，有顯著性差異(P<0.05)。

結(jié)果顯示：模型組Smad3表達(dá)顯著高于其它各組(P<0.05)；澤中組與正常組含量相當(dāng)，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；婦樂(lè)組低于澤高組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；澤高組明顯高于澤中組，有差異(P<0.05)。

3 討 論 慢性盆腔炎易導(dǎo)致盆腔粘連或輸卵管阻塞，對(duì)女性生殖健康造成嚴(yán)重影響。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)及其信號(hào)通路分子Smad3在調(diào)控膠原代謝的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡中，具有非常重要的作用[10]，TGF-β1的促纖維化作用可能主要通過(guò)Smad3途徑誘導(dǎo)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)來(lái)完成[11]。

研究表明，TGF-β是調(diào)節(jié)組織炎癥和修復(fù)的重要細(xì)胞因子。適量TGF-β1經(jīng)局部或靜脈給予，能夠促進(jìn)因糖皮質(zhì)激素影響等原因難以愈合的傷口正常愈合[12]。而組織慢性損傷后修復(fù)過(guò)度的一種病理結(jié)局就是纖維化的形成。雖然TGF-β1在正常組織受損后修復(fù)中，具有非常重要的作用，但其合成與降解失衡或過(guò)多會(huì)導(dǎo)致組織纖維化。大鼠實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)被注射TGF-β1可導(dǎo)致腎、肝等器官及注射部位組織纖維化的發(fā)生。此外， TGF-β1的持續(xù)合成釋放使ECM進(jìn)行性沉積，從而致組織纖維化和瘢痕的形成[13-14]。而TGF-β1是目前已知的對(duì)膠原合成最直接和有效的刺激劑，其激活TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要是通過(guò)與其靶細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞)上的受體結(jié)合而使膠原過(guò)度沉積導(dǎo)致纖維化的發(fā)生發(fā)展[15]。

Smads 蛋白是 TGF-β 下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子，磷酸化的 Smad2 和 Smad3 與Smad4 形成 Co-Smads 入核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)纖維化改變[16]。而Smad3是TGF-β和激活素(Activin)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中共同的關(guān)鍵信號(hào)蛋白[17]。特異性阻斷Smad3蛋白表達(dá)，有可能同時(shí)解除 TGF-β和激活素的作用，起到高效抗肝纖維化作用。

以利濕化瘀為主的澤丹沖劑中蒲公英為君藥，具有消散癰腫、清熱解毒之功效；輔以敗醬草，因其苦辛涼微寒而清熱祛瘀、解毒止痛、排膿消腫；車前子、澤瀉能淡滲利濕、化瘀止痛；丹參善調(diào)婦女經(jīng)脈而具有活血祛瘀之功效；三棱、莪術(shù)乃破血行氣之品；與丹參相伍治瘀滯腹痛；延胡索行氣活血、化瘀止痛；柴胡配香附疏肝止痛、理氣調(diào)經(jīng)[15]。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：與模型組比較，各治療組大鼠子宮組織中的TGF-β1、Smad3表達(dá)明顯降低，說(shuō)明澤丹沖劑及婦樂(lè)顆粒均可有效地降低TGF-β1、Smad3的異常表達(dá)，但澤丹高、中劑量組療效優(yōu)于婦樂(lè)組(P<0.05)。

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(收稿2014-09-29；修回2014-10-17)

Effects of Zedan infusion on Smad3 and TGF-β1 in rats with chronic pelvic inflammatory disease

Qingyuan Hospital of TCM Affiliated to Guangzhou University of TCM(Qingyuan 511500)

Gu Feng Tao Hongxing Shen Zuhong et al

Objective: To observe the effects of Zedan Infusion on Smad3 and TGF-β1 in the rats with Chronic pelvic inflammatory disease ,so as to discuss its mechanism.Methods: The rat model of chronic pelvic inflammatory disease was established by injecting coli suspension (concentration of about 6×106) 0.2ml to the bilateral intrauterine.After the modeling,the rats were randomly divided into Zedan Infusion high and medium (8g·kg, 4g·kg) dose group, Fule particle group (2.5g·kg), model group and the normal group.After oral administration 21d, the expression of TGF-β1 and Smad3 was assayed by the Western Blot. Results :Compared with the model group,the expression of TGF-β1 and Smad3 was significantly lower (P<0.05), which was better in Zedan infusion high and medium dose group than in Fule group (P<0.05).Conclusion: Zedan infusion can reduce the abnormal expressions of TGF-β1 and Smad3，has anti-tissue adhesions and fibrosis effects，thus it has good clinical efficacy on Chronic pelvic inflammatory disease．

Pelvic Inflammatory Disease/traditional Chinese medicine therapy Animal experimentation Rats @Zedan infusion

*廣東省清遠(yuǎn)市科技局博士項(xiàng)目(2013A012)

盆腔炎性疾病/中醫(yī)藥療法 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠 @澤丹沖劑

R711.33

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.057

△深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院(深圳 518000)

▲山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校(煙臺(tái) 265200)