冒有平 江蘇省如皋市中醫(yī)院藥劑科(如皋 226500)

高效液相色譜法測定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量

冒有平 江蘇省如皋市中醫(yī)院藥劑科(如皋 226500)

目的：探討高效液相色譜法測定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量。方法：色譜條件：流動相為甲醇-水-乙腈，流速為1mL/min，紫外檢測波長為250nm，進樣量10μL，柱溫35℃。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=013.614X-1.4897，相關(guān)系數(shù)R=0.9979；本實驗方法精密度符合要求，回收率高，穩(wěn)定性強，黃芪苷在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，高效液相色譜法測定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量為3.39mg/5g。結(jié)論：高效液相色譜法測定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量操作簡便迅速，精密度和穩(wěn)定性均較理想，回收含量高，可為測定中藥中黃芪苷物質(zhì)含量提供方法依據(jù)。

復(fù)方黃芪顆粒是臨床上的常用藥，具有健脾益腎，疏肝活血，清熱利濕之功效。黃芪苷是復(fù)方黃芪顆粒中主要活性物質(zhì)之一[1]。黃芪苷具有降壓、鎮(zhèn)驚、鎮(zhèn)痛作用，能增加血漿中cAMP和再生肝DNA的含量[2]；也能促進胰島素的分泌，激活延長小鼠腹腔巨噬細胞的生長，促進炎癥反應(yīng)的消失[3]。眾所周知，在當(dāng)前我國藥物的發(fā)展進程中，中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的研究是指導(dǎo)臨床合理用藥和保證中藥材質(zhì)量的主要手段[4-5]。同時我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)強調(diào)的是中藥的整體效應(yīng)，對單個成分的作用機制研究較少[6]。由于黃芪苷具有顯著的生物活性，因此高效測量黃芪苷的含量工藝有重要的意義[7]。當(dāng)前黃芪苷的測定方法有薄層色譜法(TLC)、毛細管電泳法(CZE)等，不過上述方法在含量測定中都普遍存在靈敏度不高、重復(fù)性不強的現(xiàn)象[8]。高效液相色譜在當(dāng)前生物樣品的測定中具有靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點。本文具體探討了高效液相色譜法測定復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量價值，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法 1.1 儀器與試劑 復(fù)方黃芪顆粒(四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字Z20003380)，對照品本均來自本實驗組從復(fù)方黃芪顆粒中分離得到的黃芪苷，分析純甲醇來自北京化工試劑公司，分析乙腈來自Sigma公司。高效液相色譜(HPLC)選擇Waters 2695，配套有UV waters 2996檢測器，色譜柱為SUNFIRE C18(5μm 4.8×150mm)，KQ-700DB超聲波清洗器來自昆山市超聲儀器有限公司，F(xiàn)TIR-8400S型紅外光譜儀與GSP-84-02型磁力恒溫攪拌器都來自島津公司。

1.2 色譜條件 流動相：甲醇-水-乙腈；流速：1mL/min；紫外檢測波長：250nm；進樣量：10μL；柱溫：35℃。黃芪苷純品HPLC色譜圖見圖1。

圖1 黃芪苷純品HPLC色譜圖

1.3 對照品的制備 精密稱取黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品20mg，分別精確配成0.4mg/mL、0.8mg/mL，1.2 mg/mL，1.6 mg/mL，2.0 mg/mL的溶液，搖勻，分別經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

1.4 供試品的制備 取復(fù)方黃芪顆粒200g，分別用1500mL甲醇浸泡過夜回流提取，分離得到復(fù)方黃芪顆粒粗提物5g，甲醇溶解，選擇二氯甲烷甲醇10：1(200 mL)和4：1(400 mL)洗脫，提取后溶于50mL甲醇作為黃芪苷的供試品。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別精密吸取0.15 mL，0.30 mL，0.45 mL，0.60 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各加入無水乙醇定容至0.75 mL，置于冰浴中加入7.5 mL體積分數(shù)為72%的硫酸搖勻，在30min內(nèi)，于波長250nm處測定吸光度，所求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=013.614X-1.4897，相關(guān)系數(shù)R=0.9979，線性范圍為10.2-102μg/ mL-1，表明線性回歸較好。

2 結(jié) 果 2.1 精密度試驗 取已配好的對照品黃芪苷溶液重復(fù)進樣6次，進樣量為5μL，記錄各峰面積，計算RSD值分別為1.6%、1.7%、1.8%、1.6%，1.1%和1.7%，表明本實驗方法精密度符合要求。

2.2 穩(wěn)定性實驗 取復(fù)方黃芪顆粒的粗提物溶解，在0、4、12、24h測定，進樣量為5μL，測得蒙古黃芪的黃芪苷RSD值為0.263%、0.265%，0.263%，0.266%，結(jié)果表明黃芪苷在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 加樣回收率 在加樣回收率實驗中，我們?nèi)?fù)方黃芪顆粒粗提物2.00g，分別加入黃芪苷0mg、0.50mg、1.00mg，甲醇溶解過濾，母液上硅膠柱色譜，分選擇二氯甲烷甲醇10：1(200 mL)和4：1(400 mL)洗脫，然后繼續(xù)進行微孔過濾，進樣量為5μL。各個實驗重復(fù)3次，取峰面積的平均值，結(jié)果見表1，表明其回收率高，穩(wěn)定性強。

表1 黃芪苷的加樣回收率

2.4 樣品含量 我們選擇復(fù)方黃芪顆粒的供試品溶液進樣10μL測定黃芪苷的含量，結(jié)果顯示黃芪含量為3.39mg/5g。見表2。

表2 復(fù)方黃芪顆粒的黃芪苷含量

3 討 論 黃芪是豆科黃芪屬植物，祖國醫(yī)學(xué)認為黃芪性甘，微溫，歸肺，脾經(jīng)，具有斂瘡生肌、利尿托毒、補氣固表之功效[9]。在具體的藥學(xué)機制上，黃芪對正常機體的抗體生成功能有明顯促進作用。黃芪作為常用的抗衰老中藥，可顯著提高老年大鼠的血漿皮質(zhì)醇含量[10]。黃芪合劑具有明顯的抗疲勞作用，能增強心肌收縮力，改善心臟功能。復(fù)方黃芪顆粒是當(dāng)前在臨床上應(yīng)用的一種常見藥物，該藥的功能主治為益氣、活血、熄風(fēng)、通絡(luò)。并且劑型攜帶、服用方便，當(dāng)前應(yīng)用有較高的抗乙肝病毒活性?，F(xiàn)代研究表明研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃芪顆粒中含有的黃芪苷等化合物具有較強的生物活性，具有正性肌力作用及缺血性腦損傷保護作用及抗炎作用。

色譜法是近代發(fā)展起來的一種物理及物理化學(xué)的分離分析方法，其藥物化學(xué)成分分析的色譜方法包括薄層色譜、高效液相色譜、高速逆流色譜氣相色譜、超臨界流體色譜等。

本文采用高效液相色測定了復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量，結(jié)果顯示色譜回歸曲線為Y=013.614X-1.4897，相關(guān)系數(shù)R=0.9979，線性范圍為10.2-102μg/ mL-1，表明線性回較好。同時分析結(jié)果表現(xiàn)本實驗方法精密度符合要求，黃芪苷在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，為復(fù)方黃芪顆粒中黃芪苷的含量評價提供了一定的依據(jù)。

當(dāng)前隨著分離提取、結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)的發(fā)展，復(fù)方黃芪顆粒已經(jīng)分離了多種三萜皂苷類化合物，顯示其化學(xué)成分復(fù)雜，對于有效物質(zhì)的提取與色譜分析要求更高[9]。我們在色譜分析中，建立的體系為流動相：甲醇-水-乙腈；流速：1mL/min；紫外檢測波長：250nm；進樣量：10μL；柱溫：35℃。結(jié)果顯示其回收率高，穩(wěn)定性強，黃芪含量為3.39mg/5g。同時復(fù)方黃芪顆粒中生物活性成分多樣，單一活性成分的含量不能夠反應(yīng)黃芪的生物活性的全貌，還需要我們在下一部工作中進行多活性組分含量測定，使充分發(fā)揮其藥用價值，具有重要意義[11]。

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[2] 韋尉元，吳 琨，王曉通，等.Cdx2-RNA基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌MGC-803細胞對中藥人參黃芪復(fù)方藥物敏感性的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2013，34(7)：994-998.

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(收稿2014-08-16；修回2014-09-21)

黃芪苷/分析 色譜法，高壓液相 @復(fù)方黃芪顆粒

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.051