李青松 黃 陽(yáng) 郎永英 毛春芹 陸兔林 ▲

江蘇省昆山市中醫(yī)院 (昆山 215300)

HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)方歸枳顆粒中四種成分的含量

李青松 黃 陽(yáng) 郎永英△毛春芹△陸兔林△ ▲

江蘇省昆山市中醫(yī)院 (昆山 215300)

目的：建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方歸枳顆粒中阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4種成分的反相高效液相色譜法。方法： 采用高效液相色譜法(HPLC)。色譜條件：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液。流速：1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm。結(jié)果：阿魏酸在0.0125～0.0642 mg/mL、柚皮苷在0.0801～0.4005 mg/mL、橙皮苷在0.0352～0.1760 mg/mL、新橙皮苷在0.0848～0.4240 mg/mL范圍內(nèi)均成良好的線(xiàn)性關(guān)系；相關(guān)系數(shù)分別為0.9995、0.9998、0.9996、0.9997；平均回收率分別為100.15%、97.70%、99.05%、97.75%，RSD分別為1.97%、2.05%、2.57%、1.34%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為該顆粒制劑的質(zhì)量控制方法。

復(fù)方歸枳顆粒為醫(yī)院復(fù)方中藥制劑，由當(dāng)歸、枳殼、山茱萸、續(xù)斷、訶子5味藥制成，具有補(bǔ)血養(yǎng)血，調(diào)經(jīng)止痛之功效，現(xiàn)臨床較多用于女性血虛經(jīng)閉、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)等癥，均取得良好的治療效果，達(dá)到了標(biāo)本兼治。當(dāng)歸是方中君藥，有補(bǔ)血調(diào)血之效，主要有效成分為阿魏酸；配枳殼以益氣養(yǎng)血，氣血同調(diào)，益沖任之脈，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黃酮類(lèi)成分是其主要藥效成分[1-4]。通常含量測(cè)定只測(cè)復(fù)方中的一種成分，不能全面反映復(fù)方質(zhì)量，并且未見(jiàn)報(bào)道同時(shí)測(cè)定本方多種有效成分含量的文獻(xiàn)[5]。為了提高本品的內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文建立了高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定復(fù)方歸枳顆粒中橙皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷的含量，分離效果理想，方法靈敏但穩(wěn)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥 1.1 儀 器 采用配有VWD可變波長(zhǎng)檢測(cè)器的Agilent 1100 高效液相色譜儀，應(yīng)用色譜工作站為Chem Station ；由淮陰漢邦科技有限公司生產(chǎn)的Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；由梅特勒-托利多公司生產(chǎn)的MS105DU型電子分析天平；由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-600DB型超聲波清洗器。

1.2 試 藥 復(fù)方歸枳顆粒(醫(yī)院自制，規(guī)格：10 g/袋，批號(hào)為140302、140304、140306)；對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，分別為阿魏酸(批號(hào)0773-9708)、柚皮苷(批號(hào)110722-200610)、橙皮苷(批號(hào)110721-200211)、新橙皮苷(批號(hào)110721-200206)；所用試劑乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果 2.1 色譜方法 色譜柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)218nm；流速：1.0mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL[5-7]。

2.2 制備對(duì)照品的混合液 分別精密稱(chēng)取橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸對(duì)照品適量，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成濃度為每1mL含橙皮苷0.669mg、柚皮苷1.802mg、新橙皮苷1.218mg、阿魏酸1.278mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別精密吸取適量上述溶液置于容量瓶中5mL，加甲醇稀釋至刻度，即得對(duì)照品混合液(分別為阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷為64.4μg/mL、396.0μg/mL、168μg/mL、404μg/mL)。

2.3 供試品溶液的制備 取本品約2.5 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇20 mL，稱(chēng)重；超聲處理20 min，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，濾液用微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 陰性對(duì)照液的制備 按照歸枳顆粒的處方及制備工藝，制成不含當(dāng)歸、枳殼的樣品。方法同上制成缺當(dāng)歸、枳殼的陰性樣品溶液。

2.5 陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品混合液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣；結(jié)果表明，供試品溶液中被測(cè)組分與其它成分分離良好，缺當(dāng)歸、枳殼的陰性對(duì)照品無(wú)干擾峰。見(jiàn)圖1。

1.阿魏酸 2.柚皮苷 3.橙皮苷 4.新橙皮苷A.對(duì)照品混合液 B.供試品溶液 C.陰性對(duì)照溶液圖1 高效液相色譜圖

2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品混合液0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL 、0.6 mL、0.8 mL～1 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，混合對(duì)照品母液?jiǎn)为?dú)為一組；分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，同時(shí)記錄并計(jì)算峰面積。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，將進(jìn)樣濃度x(mg/mL)設(shè)為橫坐標(biāo)，將峰面積y設(shè)為縱

坐標(biāo)。分別求得阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 四種有效成分的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍

2.7 精密度試驗(yàn) 每次取對(duì)照品混合液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面積并計(jì)算，RSD分別為1.18 %，1.92 %，2.33%，1.66 %。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為130302的供試品溶液，每隔2h進(jìn)樣一次，共6次，結(jié)果阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為2.51%、0.66%、1.09%、0.82%、表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為130302的供試品溶液，按文中色譜條件測(cè)定6次，阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均含量分別為0.1170 mg/g、2.864 mg/g、0.4422 mg/g、2.1287 mg/g；RSD分別為2.70%、1.60%、2.64%、1.89%，表明該法具有良好的重現(xiàn)性。

2.10 加樣回收率 分別精密稱(chēng)取阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，分別制成質(zhì)量濃度為0.1685 mg/mL、3.5677 mg/mL、0.5147 mg/mL、2.5263 mg/mL的對(duì)照品混合液。取已知含量的批號(hào)為140302的樣品9份，每份約1.25 g，置具塞錐形瓶中，分別加入對(duì)照品混合液0.8 mL、1 mL、1.2 mL，按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算各自回收率。阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均加樣回收率依次為100.15%、97.70%、99.05%、97.75%，RSD分別為1.97%、2.05%、2.57%、1.34%。

2.11 樣品測(cè)定 分別取批號(hào)為140302 、140304、 140306的樣品，精密稱(chēng)取約2.5 g制成供試品溶液，再取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 歸枳顆粒樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論 復(fù)方歸枳顆粒為我院多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有養(yǎng)血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛等療效，原醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有阿魏酸含量的簡(jiǎn)單測(cè)定項(xiàng)，但作為中藥復(fù)方制劑，單一成分并不能很好控制其質(zhì)量，因此，本文采用HPLC法同時(shí)測(cè)定制劑中阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4種成分的含量，為復(fù)方歸枳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù)，確定合理檢測(cè)限度[8-9]。

由于復(fù)方歸枳顆粒成分復(fù)雜，其主要有效成分的紫外吸收差異很大；我們?yōu)閷?duì)混合對(duì)照品進(jìn)行了吸收光譜掃描以保證分離、檢測(cè)的良好性。通過(guò)與單一對(duì)照品比較，除阿魏酸峰外，其他檢測(cè)成分的峰在310nm處?kù)`敏度均大幅降，且在210 nm處基線(xiàn)不穩(wěn)定，只有在218 nm處各種被測(cè)組分都能出峰，低含量組分中阿魏酸的分離度適中且檢測(cè)靈敏度、峰型也較好[8]。分析認(rèn)為，將218 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，才能實(shí)現(xiàn)吸收強(qiáng)、干擾小的目的。

為了保證樣品中檢測(cè)成分能被充分提取，查閱文獻(xiàn) ，對(duì)同一批樣品分別進(jìn)行了提取溶劑(甲醇、乙醇)、方法(超聲提取、回流提取)、時(shí)間選擇試驗(yàn)(20、30、40 min)[10-14]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇不僅提取效率高，而且供試品進(jìn)入液相雜質(zhì)干擾少；超聲提取與回流提取方法，以及提取時(shí)間對(duì)提取率均無(wú)顯著差異。綜合考慮提取率、成本等因素，選定加甲醇適量，超聲30min。

經(jīng)過(guò)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-甲醇-磷酸水溶液等4種流動(dòng)相系統(tǒng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有乙腈-甲醇-磷酸水溶液作為流動(dòng)性時(shí)，基線(xiàn)平穩(wěn)度好，待測(cè)化合物靈敏度也更高，尤其是阿魏酸的峰型好，其余各峰分離效果也較佳，分離度均達(dá)到1.5以上，故選擇乙腈-甲醇- 0.1 %磷酸水梯度為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，但注意在測(cè)定過(guò)程中要保持其穩(wěn)定。

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(收稿2014- 09-01；修回2014-09-17)

阿魏酸/分析 柚皮苷/分析 橙皮苷/分析 新橙皮苷/分析 色譜法，高壓液相

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.050

△南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(南京 210023)

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