西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外科(西安710061) 魏 疆 祿邵英

miR-27在胃癌中的表達及其作用研究

西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外科(西安710061) 魏 疆△祿邵英▲

目的：探討胃癌組織中miR-27的表達情況及miR-27對胃癌細胞系MKN-45轉移侵襲能力的影響，預測并驗證miR-27的靶向基因。方法：選取16例胃癌組織及其對應癌旁正常胃黏膜組織，通過RT-PCR檢測miR-27在胃癌中的表達情況，并分亞組比較有淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組miR-27表達水平的差異；轉染miR-27類似物(miR-27 mimics)或miR-27拮抗劑(miR-27 inhibits)及其NC對照后，用Transwell assay檢測胃癌細胞系MKN-45轉移侵襲能力的變化；用生物信息學軟件預測miR-27的靶基因，并用RT-PCR及Western-blot驗證miR-27對其靶基因表達和翻譯的調節(jié)作用。結果：miR-27在胃癌組織中表達上調，有淋巴結轉移組比無淋巴結轉移組miR-27表達水平更高；轉染miR-27 mimics后，胃癌細胞系MKN-45的轉移侵襲能力增強，轉染miR-27 inhibits后，胃癌細胞系MKN-45的轉移侵襲能力減弱；PicTar、Targetscan和miRbase三個生物信息學軟件同時預測出ZBTB10為miR-27的靶基因，RT-PCR檢測顯示：miR-27的表達對胃癌細胞中ZBTB10 mRNA的含量無影響，Western-blot檢測顯示：miR-27抑制胃癌細胞中ZBTB10蛋白的含量。結論：miR-27在胃癌中表達上調，促進胃癌細胞的轉移侵襲，其機制可能與其抑制ZBTB10蛋白的翻譯有關。

胃癌是一種全球范圍的惡性腫瘤，其發(fā)病率在男性居第4位，在女性居第5位[1]。據(jù)統(tǒng)計[2]，2008年全球共增胃癌患者989600例，占所有新增腫瘤患者總人數(shù)的8%，其中因胃癌死亡738000例，占所有因腫瘤死亡患者總人數(shù)的10%。大部分胃癌患者確診時已處于中晚期，常常伴隨遠處轉移和淋巴結轉移，此類患者即使經(jīng)過手術治療，5年生存率仍不足50%[3]。

MicroRNA是一類小分子非編碼RNA，在轉錄后水平調節(jié)基因的表達，它們通過與mRNA互補性結合而抑制mRNA的翻譯[4]。MicroRNA主要與mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)結合而誘導mRNA的脫腺苷化和去穩(wěn)定作用[5，6]。很多microRNA都被證實與腫瘤的轉移有關，它們通過影響調控腫瘤轉移的關鍵性基因的表達而發(fā)揮作用[7]。miR-27作為一個癌基因，其在胃癌中的具體作用機制尚未完全闡明。我們通過RT-PCR檢測miR-27在16例胃癌標本組織中及其對應癌旁正常胃粘膜組織中的表達情況，并通過外源性促進或抑制miR-27在體外胃癌細胞系中的表達，觀察其對胃癌細胞系轉移侵襲能力的影響，最后通過生物信息學軟件預測并通過RT-PCR及Western-bot驗證miR-27的靶基因，以期闡明miR-27對胃癌的生物學作用及其潛在的分子機制。

材料與方法

1 研究材料 選取西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科手術切除的16例胃癌標本及其對應的癌旁正常胃黏膜組織，其中男9例，女7例，中位年齡53.7歲。16例胃癌標本中有8例合并淋巴結轉移，8例無淋巴結轉移。所有病例術前均為接受化療及放療，術后均經(jīng)病理學診斷確診。胃癌標本的取材部位為瘤體正中，癌旁正常胃黏膜組織的取材部位距瘤緣5cm以上，標本收集后置于-80℃冰箱保存。人胃癌細胞系MKN-45購自中科院上海細胞庫。1640培養(yǎng)基購自購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，Trizol試劑購自美國Ambion公司，逆轉錄試劑盒及RT-PCR試劑SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自大連寶生物工程有限公司，轉染試劑 Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，miR-27 mimics/inhibits及其NC對照購自廣州銳博生物科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司，ZBTB10及β-actin抗體均購自美國Santa cruze公司。所有引物均委托上海生工生物有限公司設計并合成。

2 細胞培養(yǎng)及轉染 人胃癌細胞系MKN-45使用含10%胎牛血清、100U/ML青霉素及100U/ML鏈霉素的1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度及條件下培養(yǎng)，每周換頁2～3次。細胞生長至70%后使用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。實驗將胃癌細胞分為3組：miR-27 mimics組、miR-27 inhibits組、NC對照組，細胞接種于6孔板中待融合度為50%時按Lipo 2000說明書分別轉染。

3 RT-PCR 以Trizol-氯仿-異丙醇法抽提組織和細胞系中總RNA，NanoDrop 2000定量，根據(jù)反轉錄試劑盒操作說明獲取RT液。引物列表如附表所示，反應條件為: 預變性95℃ 3 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s，40個循環(huán)，每組設置3個復孔，實驗重復3次。

4 Western-blot 用5%濃縮膠、12%分離膠進行SDS-PAGE電泳，開始時70V恒壓約30min，待溴酚藍進入分離膠后改用120V恒壓約2h。用Bio-Rad半干電轉儀120mA轉移30min，將蛋白轉至硝酸纖維素膜。取出NC膜，洗滌后用含5%脫脂奶粉封閉液封閉1h。用含5%脫脂奶粉的PBST稀釋抗HA一抗(1∶2000)室溫孵育2h。用含5%脫脂奶粉的PBST稀釋羊抗鼠二抗(1∶2000)室溫孵育1h。發(fā)光底物孵育2min后曝光、顯影、定影。應用ChemiImage 5500自動電泳凝膠成像分析儀照相。

附表 引物列表

5 Transwell assay Matrigel置于4℃冰箱融化過夜，鋪膠操作在冰上進行，Matrigel基質膠與純1640培養(yǎng)基以1∶4的比例稀釋后18μl/孔鋪于Transwell小室正面，至于37℃干燥4h備用。常規(guī)消化離心細胞并計數(shù)后用含0.5%血清的1640培養(yǎng)基調整細胞密度使每200μl體系中含2.5× 104個細胞。使用前提前30min用無血清1640培養(yǎng)基在37℃水化凝固的Matrigel膠，接種細胞前吸走水化的1640培養(yǎng)基，200μl/孔細胞懸液接種于小室上層，小室下層每孔加入1ml含10%血清的1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。用棉簽擦去小室上層未穿透的細胞，注意動作輕柔勿損壞小室濾膜，PBS沖洗小室兩遍，室溫晾干約10min。2ml/孔甲醇固定小室背面細胞約15min，撈出小室倒置晾干15min。80μl/孔0.09%結晶紫滴于小室背面染色約5min，用自來水小心沖洗小室側面，洗去結晶紫染液，室溫晾干后倒置顯微鏡小下觀察細胞穿透情況，選取視野拍照。

6 統(tǒng)計學方法 所有計量資料的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，采用SSPS13.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行處理，實驗數(shù)據(jù)采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 miR-27在胃癌組織中的表達 我們用RT-PCR檢測了16例胃癌組織及其對應的癌旁正常胃黏膜組織中miR-27的表達水平。結果顯示：與正常胃黏膜組織相比，miR-27在胃癌組織中的表達水平顯著上調(見圖1)。MiR-27在胃癌組織中的表達水平為6.034±0.270，在正常胃黏膜組織中的表達水平為2.244±0.226，配對t檢驗結果提示t=11.91，df=15，P<0.01，說明miR-27在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達水平具有顯著性差異。隨后我們根據(jù)這16例胃癌有無淋巴結轉移將其分為兩組，每組8例，對這兩組之間的miR-27表達水平進行比較。結果顯示：有淋巴結轉移組的miR-27表達水平為6.810±0.229，無淋巴結轉移組的miR-27表達水平為5.26±0.296，成組t檢驗結果提示t=4.15，df=14，P=0.001，說明有淋巴結轉移組的胃癌組織中miR-27的表達水平高于無淋巴結轉移組，兩者有顯著差異(見圖2)。

圖 1 miR-27在胃癌組織中的表達

2 miR-27對胃癌細胞系轉移侵襲能力的影響 為了驗證miR-27對胃癌細胞系轉移侵襲能力的影響，我們選擇人胃癌MKN-45細胞系作為研究對象，分別將miR-27 類似物(miR-27 mimics)和miR-27拮抗劑(miR-27 inhibits)轉染至MKN-45細胞系中，轉染24h后用RT-PCR驗證miR-27類似物和拮抗劑的轉染效率，并用Transwell assay驗證miR-27對MLN-45轉移侵襲能力的影響。MiR-27轉染效果如圖所示(見圖3～4)結果顯示：miR-27對胃癌細胞系MKN-45的轉移侵襲能力具有促進作用，轉染了miR-27類似物的MKN-45，其轉移侵襲能力增強(見圖5)；而轉染了miR-27拮抗劑的MKN-45細胞系，其轉移侵襲能力顯著減弱(見圖 6)。

圖2 淋巴結轉移與miR-27表達的關系

圖3 miR-27類似物的轉染效率

圖4 miR-27拮抗劑的轉染效率

圖5 轉染miR-27類似物后MKN-45轉移侵襲能力的變化

圖6 轉染miR-27拮抗劑后MKN-45轉移侵襲能力的變化

3 miR-27靶基因的預測及驗證 MicroRNA通過與其靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)互補而在轉錄后水平抑制靶基因mRNA的翻譯。為了進一步探究miR-27對胃癌轉移侵襲促進作用的生物學機制，我們用PicTar、Targetscan、miRbase三個生物信息學軟件預測了miR-27的潛在靶基因，三個生物信息學軟件的預測結果均提示ZBTB10基因為miR-27的靶向基因。ZBTB10基因是鋅指蛋白家族的主要成員之一，與腫瘤的上皮間質轉化(EMT)及轉移侵襲密切相關。為了進一步驗證miR-27對ZBTB10的抑制作用，我們用RT-PCR和Western-blot檢測了轉染miR-27類似物及抑制劑后MKN-45中ZBTB10的表達水平。RT-PCR結果顯示：miR-27類似物和拮抗劑轉染前后，MKN-45中ZBTB10基因的表達水平無顯著性差異(P>0.05)。MiR-27類似物轉染組的ZBTB10 mRNA表達水平為1.230±0.292，miR-27拮抗劑轉染組的ZBTB10 mRNA表達水平為1.190±0.194，陰性對照組的ZBTB10 mRNA表達水平為1.380±0.196，miR-27類似物和陰性對照組之間t檢驗的P=0.704，miR-27拮抗劑和陰性對照組之間t檢驗的P=0.535，說明ZBTB10基因的表達水平在miR-27類似物和陰性對照組之間及miR-27拮抗劑和陰性對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。Westren-blot結果顯示：miR-27類似物和拮抗劑轉染前后，MKN-45中ZBTB10蛋白的含量存在顯著差異(P<0.05)。轉染miR-27類似物后，MKN-45中ZBTB10蛋白的含量顯著降低，而轉染miR-27拮抗劑后，MKN-45中ZBTB10蛋白的含量顯著升高(P<0.05)。以上實驗結果提示：在胃癌細胞系MKN-45中，ZBTB10為miR-27的靶向基因，miR-27通過抑制ZBTB10 mRNA的翻譯來促進胃癌細胞的轉移侵襲作用，而對ZBTB10的表達無明顯影響(見圖7～8)。

圖7 miR-27對ZBTB10表達的影響

討 論

MicroRNA是一類約23個核苷酸長度的小分子非編碼RNA，它們通過抑制mRNA的翻譯而在轉錄后水平調節(jié)基因的表達。MicroRNA對mRNA的轉錄后抑制是通過microRNA種子區(qū)和mRNA3’端非翻譯區(qū)的堿基互補配對來完成的[4]。MicroRNA主要通過mRNA3’端非翻譯區(qū)的互補序列來識別目標mRNA。然而，近期一些研究表明：microRNA也可以與目標mRNA的5’端非翻譯區(qū)和開放閱讀框結合[8]。當microRNA和目標mRNA結合后，microRNA通過脫腺苷化和去穩(wěn)定作用來抑制目標mRNA的翻譯。MicroRNA與目標mRNA的互補程度決定了microRNA的功能。如果microRNA和目標mRNA不完全互補，microRNA的功能通過抑制目標mRNA翻譯來實現(xiàn)，如果microRNA和目標mRNA完全互補，則microRNA的功能將通過降解目標mRNA來實現(xiàn)[9]。

圖8 miR-27對ZBTB10翻譯的影響

很多microRNA均被證實與胃癌的轉移有著密切的關系，它們參與胃癌轉移的各個方面的調控，包括上皮間質轉化、失巢凋亡、血管生成、遷移和侵襲等[10]。MiR-27，作為一個癌基因，在腫瘤組織中往往過表達，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個方面。崔秀英等研究指出：miR-27在乳腺癌組織中高表達可能與乳腺癌的惡性程度及預后有關,有可能成為乳腺癌新的預后指標及治療靶點[11]。MiR-27還可能通過調控FOXO1表達在腎癌中起致癌作用[12]。對胃癌患者外周血的分析顯示：miR-27在胃癌患者的外周血中含量明顯升高，可作為胃癌的良好預后指標[13]。

我們對16例胃癌標本組織及其對應的癌旁組織中miR-27的表達進行了檢測，結果顯示：miR-27在胃癌組織中表達較癌旁組織高，并且miR-27過表達的水平與淋巴結轉移相關，伴有淋巴結轉移的胃癌組織中miR-27的表達水平高于無淋巴結轉移的胃癌組織，說明miR-27作為癌基因在胃癌中過表達，其具有促進胃癌轉移侵襲的作用，這一作用也得到了體外細胞實驗的驗證。在胃癌細胞系MKN-45中外源性過表達miR-27后，其轉移侵襲能力增強，而外源性抑制miR-27的表達后，其轉移侵襲能力減弱。生物信息學軟件預測ZBTB10為miR-27的靶基因，我們用RT-PCR和Western-blot檢測了miR-27對ZBTB10基因表達和翻譯的影響。結果顯示：miR-27能抑制ZBTB10 mRNA的翻譯，而對ZBTB10基因的表達無影響。以上結果說明miR-27在胃癌中過表達，對胃癌的轉移侵襲具有促進作用那個，其作用可能通過抑制ZBTB10 mRNA的翻譯而實現(xiàn)。

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(收稿：2014-09-20)

胃腫瘤/病理生理學 癌基因/代謝 @ miR-27

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.05.046

△進修醫(yī)師：陜西省鎮(zhèn)巴縣人民醫(yī)院外一科

▲通訊作者