陜西省人民醫(yī)院肝膽外科(西安710068)

李 暉 吳武軍 范志勇 宋 勇 胡海田

缺氧誘導因子-1α在膽囊癌組織中的表達及臨床意義*

陜西省人民醫(yī)院肝膽外科(西安710068)

李 暉 吳武軍 范志勇 宋 勇 胡海田

目的：探討缺氧誘導因子(HIF-1α)在膽囊癌組織中的表達及其臨床意義。方法：選取30例膽囊癌組織作為觀察組，18例正常慢性膽囊炎組織作為對照組，對觀察組和對照組分別利用免疫組織化學技術來檢測石蠟病理切片組織中HIF-1α的表達情況，進一步分析HIF-1α與膽囊癌臨床病理因素及預后之間的關系。結果：HIF-1α蛋白在30例膽囊癌組織中的陽性表達率為63.3%(19/30) , 而在18例膽囊炎組織中均未見表達,兩者間有極顯著性差異(P<0.01)。HIF-1α表達與腫瘤TNM分期(P<0.05)及淋巴結轉移以及腫瘤的大小呈正相關(P<0.05)，而與膽囊癌組織分化程度、患者的年齡和性別等無關(P>0.05)，與預后呈負相關((35.0% vs 16.7%，P<0.05)。結論：HIF-1α的在膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，可作為判斷膽囊癌診斷及預后的有用指標。

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，我國流行病學調查研究顯示其位于消化道惡性腫瘤的第6位，近20年來其發(fā)病率有上升趨勢[1]。原發(fā)性膽囊癌早期癥狀不明顯且無特異性，診斷時往往已處于晚期，且膽囊癌惡性程度高，浸潤快，極易轉移。手術治療仍是目前治療膽囊癌最主要的方法，但手術切除率低，預后差，5年生存率僅為5%～13%[2，3]。因此，探索采用新的檢測指標，研究其在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉移中的作用機理，將對膽囊癌的臨床診斷、預后評價及靶向治療產生極大的指導價值。有研究證實：缺氧是腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一，腫瘤的進展常常伴有腫瘤細胞的迅速增殖以及微環(huán)境的缺氧狀態(tài)[4]。缺氧誘導因子-1是腫瘤細胞對抗缺氧的環(huán)境而生成的一種蛋白即核轉錄調控因子，研究證明：在多種癌前病變及惡性腫瘤中均有HIF-1α的過度表達，能調節(jié)缺氧反應基因產物的合成，能夠改善腫瘤細胞的能量代謝，促進血管形成，促使細胞增殖轉移[5]。本研究旨在探究膽囊癌組織中 HIF-1α的表達與否及相關臨床意義。

資料與方法

1 研究對象 隨機抽取2008年9月至2010年9月在我院行手術治療的膽囊癌患者30例,進行隨訪6～40個月的隨訪，平均隨訪 25個月。其中男9例，女21例，年齡45～85歲，中位年齡65.83歲，均已經病理確診為膽囊腺癌，其中高分化膽囊癌 10例，中分化膽囊癌9例，低分化膽囊癌 11例。另取2008年9月至2010年9月手術切取的18例慢性膽囊炎組織，均取自因患膽囊結石而切除膽囊的患者的膽囊壁，取材時避開出血及壞死組織，鏡下診斷全部為慢性膽囊炎。根據1995年UICC制定的膽囊癌TNM分期標準，I+II期7例，III期16例，IV期7例。

2 免疫組化染色方法

2.1 S-P法檢測HIF-1α步驟：以5μm為厚度連續(xù)石蠟切片,脫蠟并逐級脫水，蒸餾水沖洗10min，為消除內源性過氧化物酶置于0.3%的H2O2中10min，以pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次。滴加正常兔血清(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)，室溫孵育25min，pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，去多余液體，滴加一抗(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司 1：100)放于4℃冰箱放置一晚。將已被生物素標記的羊抗兔二抗Ig G(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)滴入并放置于室溫15min后，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗后滴加DAB顯色劑，蘇木素復染，經脫水封片等操作后顯微鏡下觀察。

3 結果評估 采用半定量積分法判斷陽性結果：按染色強度評：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分；棕褐色為3分；在400倍的高倍鏡視野下取10個視野，每個視野選取100個細胞，計算陽性細胞的百分數：細胞陽性率為0得0分，<25%得1分，25%～50%得2分，>50%得3分。二者積分乘積<2為陰性，>2為陽性。

4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0對腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM與HIF-1的關系用卡方檢驗進行檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法并用Log-rank檢驗，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異

結 果

1 HIF-1α在膽囊癌中的表達 見圖1。HIF-1α蛋白在膽囊癌組織中的陽性表達率為63.3% (19/30)；膽囊炎組織內HIF-1α表達評分均小于2分，提示無HIF-1α的過表達。

2 HIF-1α表達與臨床病理的關系 見附表。HIF-1α的表達與患者的年齡及性別無關(P>0.05)。HIF-1α蛋白的表達增高與腫瘤的淋巴結轉移(P=0.043)及TNM分期(P=0.021)密切相關，而與腫瘤的分化程度無關(P=0.135)。膽囊癌的TNM分期越高，HIF-1α表達率越高。

3 HIF-1α表達對膽囊癌患者預后的影響 生存曲線見圖2。19例HIF-1α表達陽性的膽囊癌患者的3年生存率為16.7%，而11例HIF-1α表達陰性的患者3年生存率為35.0%。中位生存時間分別為19和35個月，具有顯著性差異(P=0.037)。

圖1 HIF-1α表達陽性(HE ×200)

臨床病理因素HIF?1α陽性n(%)χ2值P值年齡 ≤60歲 >60歲7(58．3%)12(66．7%)0．2150．643性別 男 女5(55．6%)14(66．7%)0．3350．563腫瘤分化程度 高分化 中分化 低分化40%(4)66．6%(6)81．8%(9)4．0060．135淋巴結轉移 有 無73．9%(17)28．6%(2)4．7510．043TNM分期 I+II III IV28．6%(2)62．5%(10)100%(7)7．7000．021腫瘤大小 ≤2cm 2～5cm >5cm3(37．5%)9(69．2%)8(88．9%)4．8140．028

圖2 生存曲線

討 論

膽囊癌是膽道系統(tǒng)常見的高度惡性腫瘤,占消化道腫瘤第6[1],其惡性程度高,起病隱匿,早期診斷較困難,患者就診時多屬中晚期,預后較差。膽囊癌的發(fā)生與性別、年齡、職業(yè)、種族等均有著密切關系，因此提高膽囊癌的早期診斷水平及預后判斷，對臨床診療及治療方案的選擇有重要意義。膽囊癌是一種實體惡性腫瘤，其快速增殖和相對血供缺乏造成腫瘤細胞局部缺氧，腫瘤細胞為適應缺氧環(huán)境，通過調控相應靶基因表達出乏氧誘導因子-1，從而激活腫瘤血管生成，改善腫瘤細胞代謝，為腫瘤組織增加血、氧、能的供應。 HIF-1α與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

缺氧條件下哺乳動物和人體內產生的HIF-1是一種二聚體轉錄因子，主要由HIF-1α和HIF-1β兩個組份結合而組成，對缺氧誘導的基因表達起著關鍵性作用[6]。HIF-β功能相對較弱，HIF-1α是主要的功能基團，對氧的較為敏感，決定了HIFα的活性。乏氧狀態(tài)下HIF-1α被活化，通過調節(jié)下游靶基因而導致包括腫瘤細胞適應低氧,血管生成和浸潤等一系列的生物學反應[7,8]。國內外大量實驗研究均證實了HIF-1α在惡性腫瘤中的高表達。Zhong等[9]發(fā)現了至少13 腫瘤的細胞中HIF-1α呈不同程度的表達。筆者也在既往的研究中發(fā)現HIF-1α在胰腺癌中過表達，而在胰腺正常組織中表達為陰性[10]。Erdenebulgan等[11]研究發(fā)現：在膽囊癌的患者中HIF-1α的高表達與淋巴結轉移以及靜脈侵犯相關，提示預后較差，HIF-1α可作為預測膽囊癌惡性行為的輔助參數。本實驗研究數據顯示：HIF-1α蛋白在30例膽囊癌組織中的陽性表達率為63.3%(19/30) , 而在18例膽囊炎組織中均未見表達,兩者間有極顯著性差異。提示HIF-1α可用于膽囊癌的輔助診斷,與國內外其他學者研究結果相一致[10～12]。我們的實驗結果也提示了HIF-1α與腫瘤淋巴結轉移(0.043)、TNM分期以及腫瘤大小呈正相關，與腫瘤病理分級、患者年齡以及性別無關，這與國內外其它學者的研究結果基本一致[11,12]，說明膽囊癌局部癌細胞過量表達HIF-1α，以適應相對缺氧的腫瘤微環(huán)境，HIF-1α在膽囊癌發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用，與膽囊癌病情的進展及預后密切相關，HIF-1α的檢測對評估患者的病情有輔助作用。有關患者的預后及生存率，我們利用Kaplan-Meier分析及生存曲線得出，膽囊癌患者的預后與HIF-1α的表達呈負相關，HIF-1α的過表達的膽囊癌患者與無HIF-1過表達的患者相比，中位生存時間顯著不同，提示HIF-1α是預測膽囊癌預后的重要指標，這些與國外學者研究結果一致[11，12]?？傊?HIF-lα蛋白表達水平的檢測對膽囊癌的診斷、分期、療效判斷及預后判斷有重要價值。

有關腫瘤缺氧問題研究日益深入，而以HIF-1α為靶點的基因治療研究將有效得阻斷氧信號的阻斷，特異性阻斷腫瘤細胞對缺氧環(huán)境的適應，減少腫瘤血管生成和腫瘤浸潤。對特異性阻斷HIF-1α信號通路的藥物的研究將為膽囊癌和其他實體腫瘤的治療開辟新的方向。

[1] 鄒聲泉，張 林. 全國膽囊癌臨床流行病學調查報告[J]. 中國實用外科雜志,2000,20(1):43-46.

[2] Hundal R,Shaffer EA.Gallbladder cancer: epidemiology and outcome[J].Clin Epidemiol，2014 ,7(6):99-109.

[3] Donohue JH.Present status of the diagnoses and treatment of gallbladdercarcinoma[J].J Hepatobiliary Panereat Surg，2001，8(6):530-534.

[4] Marx J.Cell biology：How cells endure low oxygen[J].Science,2004，303 (5663): 1454-1456.

[5] Caro J. Hypoxia regulation of gene transcription[J]. High Alt Med Biol,2001,6(2):145-154.

[6] 樊利芳,刁路明.缺氧誘導因子-1與腫瘤[J]. 中華病理學雜志,2002, 31(2)：168-170.

[7] 朱 宏, 施瑞華. 缺氧誘導因子與腫瘤血管生成[J]. 國外醫(yī)學腫瘤學分冊，2004 ,31(8):591-593.

[8] Shi YH,Fang WG .Hypoxia-inducible factor-l in tumor angiogenesis[J].World J Gastmenterol,2004,10(8) :1082-1087.

[9] Zhong H.Over expression of HIF-1αin common human Cancer and their metastases[J] .Cancer Res,1999,59(22):253-255.

[10] 李 暉，吳武軍. 缺氧誘導因子-1在胰腺癌組織中的表達及臨床意義[J]. 現代腫瘤醫(yī)學，2011, 19(11):2257-2260.

[11] Batmunkh E, Shimada M, Morine Y，etal. Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1α) in patients with the gallbladder carcinoma[J].Int J Clin Oncol,2010, 15(1):59-64.

[12] Sun W, Shen ZY ,Zhang H ,etal. Overexpression of HIF-α in primary gallbladder carcinoma and its relationship to vasculogenic mimicry and unfavourable prognosis[J]. Oncol Rep，2012，27(6)：235.

(收稿：2014-11-16)

The significance and expression of HIF-1α in gallbladder carcinoma

Department of Hepatobiliary Surgery，Shaanxi Provincial Hospital

(Xi’an 710068) Li Hui Wu Wujun Fan Zhiyong et al

Objective：To detect the expression of HIF-1α(hypoxia inducible factor lα) in the tissue of gallbladder carcinoma and to evaluate its clinical significance. Methods：HIF-1α was examined in 30 patients of primary gallbladder carcinoma and in 18 patients suffering cholecystitis respectively using Immunohistochemistry technology,and then analyze the relationship between clinico-phathological factor of gallbladder carcinoma and the expression of HIF-1. Results： The positive rate of HIF-1 in gallbladder carcinomas was 63.3%(19/30). In 18 cases of cholecystitis ,no HIF-1αexpression was detected. The positive rate of HIF-1 in gallbladder carcinomas was significantly higher than that in the tissues of cholecystitis (P<0.01). HIF-1 protein expression was closely relevant with lymphatic metastasis(P=0.043), TNM stage(P=0.021)and tumor size(P=0.028) while was negative correlations with prognosis((35.0% vs 16.7%,P=0.037), but uncorrelated with the pathological grading,the age and sex of patients(P>0.05) . Conclusion： High expression of HIF-1 plays a considerable role in development of gallbladder carcinoma. HIF-1 could possibly become a helpful marker for diagnosing and assessing prognosis in the carcinoma of gallbladder .

Gallbladder neoplasms/pathology Immunohistochemistry @HIF-1

*陜西省科學技術研究發(fā)展計劃項目(2014K11-03-03-11)

膽囊腫瘤/病理學 免疫組織化學 @缺氧誘導因子

R735.8

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.05.028