西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科(西安710002)

劉佩勇 謝 梅 紀(jì)玉強(qiáng)# 趙 朝▲ 程曼麗

·論著·基礎(chǔ)研究·

長(zhǎng)鏈非編碼RAN ENST00000447336在氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)*

西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科(西安710002)

劉佩勇 謝 梅 紀(jì)玉強(qiáng)#趙 朝▲程曼麗

目的：檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RAN (lncRNA) ENST00000447336在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的表達(dá)水平。方法：采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)ox-LDL誘導(dǎo)的損傷HUVEC與正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336表達(dá)水平。結(jié)果：ox-LDL誘導(dǎo)的損傷HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平(0.65±0.17)明顯高于正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平(0.29±0.11)，二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平增高，lncRNA-ENST00000447336可能參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子，不編碼蛋白但可以調(diào)控基因的表達(dá)水平，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理過(guò)程，同時(shí)與多種疾病病理過(guò)程密切相關(guān)[1-3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了心臟、血管的生長(zhǎng)和分化，與動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、擴(kuò)張性心肌病及強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良性心臟病等有關(guān)[4-9]。我們前期研究[10]利用Human lncRNA芯片比較氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作用后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)和正常HUVEC的lncRNA和mRNA表達(dá)水平，篩選出了HUVEC損傷相關(guān)的lncRNA，其中l(wèi)ncRNA ENST00000447336增高12倍，為進(jìn)一步驗(yàn)證芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)ox-LDL誘導(dǎo)的損傷HUVEC與正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336表達(dá)水平，為研究lncRNA參與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 細(xì)胞與材料 HUVEC-12內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海研究所細(xì)胞庫(kù)，Trizol液(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，定量PCR試劑(大連寶生物工程有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：取HUVEC細(xì)胞適量接種于含DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/ml)中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換半液，生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，待細(xì)胞融合達(dá) 80%以上進(jìn)行細(xì)胞傳代。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)60%～70%時(shí)加入ox-LDL(終濃度100 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞總RNA的提?。喝?×106個(gè)細(xì)胞，完全吸去培養(yǎng)液后加1ml的RNA抽提試劑Trizol液提取細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。使用Nanodrop-1000分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260nm、280nm和230nm的吸收值，計(jì)算RNA濃度并評(píng)估純度，使用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度及完整性。

2.3 cDNA合成：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，1.5 μg RNA、0.5μl 引物(10μM) 、 3.2μl dNTPs Mix(1.25mM)、加無(wú)RNA酶的H2O至總體積14.5 μl，混勻后在65℃水浴5min，冰上放置2 min。短暫離心后，在離心管中依次加入4 μl RT反應(yīng)液5X First-Strand Buffer 、1μl 0.1 M DTT、0.3 μl RNase Ihibitor、0.2 μl SuperScript III RT混合后37℃恒溫1 min，50℃溫育60 min，70℃ 溫育15 min后-20℃保存。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)lncRNA-ENST00000447336的表達(dá)：利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)合成ENST00000447336及內(nèi)參GAPDH引物序列，ENST00000447336上游引物5'-TCACTTCCTCCATTTATGTTTCC-3'，下游引物5'-AACAATATGCAGCGACTGTGAAG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度79bp；GAPDH上游引物5'- GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游引物5'- GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度299bp。10μl PCR反應(yīng)體系包括：5 μl 2 × Master Mix、0.5μl 10μM 的PCR上游引物、0.5μl 10μM 的PCR下游引物及2μl cDNA，反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 10 s、60℃ 60 s共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后得到循環(huán)閾值即Ct值，每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。基因表達(dá)水平采用2-△△CT進(jìn)行分析，ΔΔCt =實(shí)驗(yàn)組ΔCt (目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)-對(duì)照組ΔCt(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct) 。

結(jié) 果

1 RNA樣本質(zhì)量分析 細(xì)胞總RNA 的OD260/280比值在1.8～2.0之間，OD260/230比值大于1.8，所有樣本的 RNA 質(zhì)量均滿足檢測(cè)要求，RNA電泳結(jié)果顯示電泳顯示5S、18S、28S條帶清晰，28S條帶的亮度大約是18 S的兩倍，證實(shí)從細(xì)胞提取的RNA完整性好，無(wú)降解，見(jiàn)附圖。

附圖 RNA樣本電泳

2 lncRNA-ENST00000447336在ox-LDL誘導(dǎo)的損傷HUVEC中的表達(dá)水平 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示ox-LDL誘導(dǎo)的損傷HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平為(0.65±0.17)，明顯高于正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平(0.29±0.11)，二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.355，P=0.001)。

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是動(dòng)脈硬化的血管病中最常見(jiàn)、最重要的一種，是多種心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅著人們的健康。其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，曾有多種學(xué)說(shuō)從不同角度來(lái)闡述，包括脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、血栓形成學(xué)說(shuō)、平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說(shuō)等。近年來(lái)多數(shù)學(xué)者支持“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為各種主要危險(xiǎn)因素最終損傷動(dòng)脈內(nèi)膜，而粥樣硬化病變的形成是動(dòng)脈對(duì)內(nèi)皮、內(nèi)膜損傷做出的驗(yàn)證-纖維增生性反應(yīng)的結(jié)果。血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cells，VEC)的損傷和功能障礙是AS發(fā)生和發(fā)展的始動(dòng)因素和中心環(huán)節(jié)之一[11-12]。由于VEC損傷和功能障礙是啟動(dòng)As事件，從保護(hù)VEC的形態(tài)及功能這一新的角度研究新型有效的抗AS的方法，對(duì)于AS疾病的防治具有良好的發(fā)展前景及臨床使用價(jià)值。

lncRNA是在小鼠全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)大規(guī)模測(cè)序時(shí)首次被提出來(lái)[13]，是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子，不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上(表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)調(diào)控基因的表達(dá)水平，根據(jù)lncRNA與蛋白編碼基因的相對(duì)位置關(guān)系可分為正義型、反義型、內(nèi)含子型、雙向型及基因間型五種類(lèi)型[14-15]。目前研究表明，lncRNA參與了調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化與凋亡等生理過(guò)程，與腫瘤、感染性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[1-3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)lncRNA也參與了心臟的發(fā)育及動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、擴(kuò)張性心肌病及強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良性心臟病等過(guò)程。lncRNA-ANRIL(Antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL)即 INK4 基因座上的反義非編 RNA，位于染色體 9p21 區(qū)域 ；一項(xiàng)大規(guī)模的病例對(duì)照研究示 ANRIL 基因攜帶者較非攜帶者顯著增加心肌梗死的患病風(fēng)險(xiǎn)[16]。另外一項(xiàng)大規(guī)模病例-對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)lncRNA- MIAT (Myocardial infarction-associated transcript，MIAT)基因的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)與心肌梗死密切相關(guān)[17]。Tie-1(表皮生長(zhǎng)因子等位基因 1)的反義RNA 屬于長(zhǎng)鏈非編碼 RNA，可以與Tie-1 mRNA結(jié)合，下調(diào)Tie-1的表達(dá)水平，而Tie-1是細(xì)胞表面酪氨酸激酶的一種受體，對(duì)胚胎發(fā)育中內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義。為了進(jìn)一步研究lncRNA在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，我們前期實(shí)驗(yàn)[10]利用Human lncRNA Array芯片比較ox-LDL作用后的HUVEC和正常HUVEC的lncRNA和mRNA表達(dá)水平，篩選HUVE損傷相關(guān)的lncRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常HUVEC，在ox-LDL 誘導(dǎo)損傷HUVEC表達(dá)上調(diào)和下調(diào)超過(guò) 2 倍的 lncRNA和mRNA有 139 種和113種，lncRNA上調(diào)和下調(diào)超過(guò) 4 倍的分別有 30 種和 8 種，mRNA上調(diào)和下調(diào)超過(guò) 4 倍的分別有 21 種和 7 種，其中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336增高12倍，但芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要進(jìn)一步驗(yàn)證。我們采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)lncRNA-ENST00000447336在ox-LDL 誘導(dǎo)損傷HUVEC中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示ox-LDL誘導(dǎo)的損傷HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平明顯高于正常HUVEC中l(wèi)ncRNA-ENST00000447336水平，這與芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。lncRNA-ENST00000447336來(lái)源于Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)，長(zhǎng)度333個(gè)核苷酸，定位于Chromosome 7: 103，030，104-103，031，354，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的具體作用有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，芯片實(shí)驗(yàn)及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)均證實(shí)lncRNA-ENST00000447336在示ox-LDL誘導(dǎo)的損傷HUVEC中高表達(dá)，可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程有關(guān)，隨著對(duì)lncRNA的研究深入將為為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制的研究提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

[1] Wapinski O，Chang HY. Long noncoding RNAs and human disease [J]. Trends Cell Biol，2011，21(6):354-361.

[2] Liu MX，Chen X，Chen G，etal. A computational framework to infer human disease-associated long noncoding RNAs [J]. PLoS One，2014，9(1):e84408.

[3] Bhan A，Mandal SS. Long noncoding RNAs: Emerging stars in gene regulation，epigenetics and human disease [J]. Chem Med Chem，2014，9(9):1932-1956.

[4] Thum T，Condorelli G. Long noncoding RNAs and microRNAs in cardiovascular pathophysiology [J]. Circ Res，2015，116(4):751-762

[5] Uchida S，Dimmeler S. Long noncoding RNAs in cardiovascular diseases [J]. Circ Res，2015，116(4):737-750.

[6] Leung A，Natarajan R. Noncoding RNAs in vascular disease [J]. Curr Opin Cardiol，2014，29(3):199-206.

[7] Papait R，Kunderfranco P，Stirparo GG，etal. Long noncoding RNA: A new player of heart failure [J]. J Cardiovasc Transl Res，2013，6(6):876-883.

[8] Scheuermann JC，Boyer LA. Getting to the heart of the matter: Long non-coding RNAs in cardiac development and disease [J]. EMBO J，2013，32(13):1805-1816.

[9] Schonrock N，Harvey RP，Mattick JS. Long noncoding RNAs in cardiac development and pathophysiology [J]. Circ Res，2012，111(10):1349-1362.

[10] Ji Yuqiang，Zhao Zhao，Li Xia，etal. Microarray Expression Profile Analysis of Long Noncoding RNAs in Endothelial Dysfunction [J]. Journal of the American College of Cardiology，64(16S): C11.1

[11] 陳文璐，吳小三，馬曉媛，等. 血管生成素與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的研究進(jìn)展 [J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014，43(4): 495-498.

[12] Davignon J，Ganz P. Role of endothelial dysfunction in atherosclerosis [J]. Circulation，2004，109(23 Suppl 1):III27-32.

[13] Okazaki Y，F(xiàn)uruno M，Kasukawa T，etal. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60，770 full-length cDNAs [J]. Nature，2002，420(6915): 563-573.

[14] Orom UA，Shiekhattar R. Long non-coding RNAs and enhancers [J]. Curr Opin Genet Dev，2011，21(2):194-198.

[15] De Lucia F，Dean C. Long non-coding RNAs and chromatin regulation [J]. Curr Opin Plant Biol，2011，14(2):168-173.

[16] Johnson AD，Hwang SJ，Voorman A，etal. Resequencing and clinical associations of the 9p21.3 region: A comprehensive investigation in the Framingham heart study [J]. Circulation，2013，127(7):799-810

[17] Ishii N，Ozaki K，Sato H，etal. Identification of a novel non-coding RNA，MIAT，that confers risk of myocardial infarction [J]. J Hum Genet，2006，51(12):1087-1099.

(收稿：2015-06-30)

Expression of long noncoding RNA ENST00000447336 in oxidized low-density lipoprotein induced vascular endothelial cell Department of Cardiovascular Medicine，F(xiàn)irst Hospital of Xi’an

(Xi’an 710002)

Liu Peiyong Xie Mei Ji Yuqiang et al

Objective: To detect the expression long noncoding RNA (lncRNA)ENST00000447336 in oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) induced human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) compared with normal HUVEC. Methods: The expression level of lncRNA-ENST00000447336 in ox-LDL induced HUVEC was detected by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: Compared with normal HUVEC(0.29±0.11)，the expression level of lncRNA-ENST00000447336in ox-LDL treated HUVEC(0.65±0.17) was statistically higher. Conclusion: The expression level of lncRNA-ENST00000447336in ox-LDL induced HUVEC increased. lncRNA-ENST00000447336may be involved in the damage of HUVEC.

RNA,Long noncoding Endothelium,vascular Endothelial cells @Oxidized low-density lipoprotein

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81470550)

RNA，長(zhǎng)鏈非編碼 內(nèi)皮，血管 內(nèi)皮細(xì)胞 @氧化型低密度脂蛋白

R364.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.001

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(212170)

#西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

▲西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院