西安市中心醫(yī)院感染科(西安710003)

杜方雄 何 敏▲ 廉國(guó)利▲△

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)肺外結(jié)核病的輔助診斷價(jià)值*

西安市中心醫(yī)院感染科(西安710003)

杜方雄 何 敏▲廉國(guó)利▲△

目的：評(píng)價(jià)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)在肺外結(jié)核病診斷中的敏感性。方法：對(duì)87例初治的肺外結(jié)核病患者進(jìn)行了酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)、病理檢測(cè)、痰涂片找結(jié)核桿菌、結(jié)核PCR檢測(cè)及結(jié)核IgG的檢測(cè)，比較了不同方法的敏感性，并觀察了酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)在不同部位肺外結(jié)核病中的敏感度。結(jié)果： ELISPOT對(duì)肺外結(jié)核感染的敏感度為73.6%，明顯高于病理檢測(cè)(37.3%)、痰涂片(6.5%)、結(jié)核抗體檢測(cè)(14.6%)及結(jié)核PCR的檢測(cè)(3.8%)。不同肺外結(jié)核感染酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)的敏感度不同。結(jié)論：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)可作為肺外結(jié)核病診斷的重要檢測(cè)方法，其在不同部位結(jié)核感染中的診斷價(jià)值不同。

有研究顯示肺外結(jié)核病約占結(jié)核病的15%～25%[1]，在我國(guó)約9.7%～11.8%。由于其感染部位多樣，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，易誤診及漏診，診斷非常困難，急需新的高敏感的方法輔助診斷。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)在肺外結(jié)核中的應(yīng)用較少。我們用ELISPOT試驗(yàn)檢測(cè)了87例肺外結(jié)核病患者，并與常用的其它診斷方法進(jìn)行了比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象 選取西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年1月至2014年12月收治的肺外結(jié)核病住院患者87例。所有患者經(jīng)病原學(xué)、組織病理學(xué)、結(jié)核抗體、TB-PCR及影像學(xué)等檢查結(jié)合臨床病史或診斷性治療確診。其中男49例，女38例。

2 試驗(yàn)方法 患者入院后行病理檢測(cè)、結(jié)核聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、痰涂片抗酸染色、結(jié)核抗體檢查及ELISPOT檢測(cè)。ELISPOT檢測(cè)使用T SPOT-TB(英國(guó)Oxford Immunotec Let)試劑盒。

ELISPOT操作方法：①采集患者外周靜脈血3～4ml，肝素抗凝，于6h內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn) ②Ficoll液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105個(gè)/ml，加入預(yù)包被INF-γ抗體的96孔微孔板里，每份4個(gè)孔，分別作為陽(yáng)性對(duì)照陰性、兩種實(shí)驗(yàn)抗原及陰性對(duì)照;③加入抗原:按照分組相應(yīng)加入植物血凝素PHA、抗原A(ESAT-6)、抗原B(CFP-10)、細(xì)胞培養(yǎng)液。 ④溫箱培養(yǎng) 24 h; PBS洗板4次，加入生物素標(biāo)記的二抗;加入親合素標(biāo)記的酶結(jié)合物,使底物顯色;⑤結(jié)果判斷:用計(jì)算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)進(jìn)行斑點(diǎn)閱讀與統(tǒng)計(jì)。陽(yáng)性對(duì)照孔如出現(xiàn)斑點(diǎn)，說(shuō)明試驗(yàn)成功。當(dāng)測(cè)試孔A或B達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽(yáng)性結(jié)果：①如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6。②如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)必須≥2倍的陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，配對(duì)資料進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺外結(jié)核病患者基本情況和結(jié)核病累及部位 結(jié)核病患者的平均年齡為44.58歲(0.75～87歲)。其中受累最多的部位是骨/關(guān)節(jié)結(jié)核(n=22)，其次為胸膜和腹膜(分別為n=19)。在這些肺外結(jié)核患者中T-SPOT陽(yáng)性率為73.6%，其中T-SPOT陽(yáng)性率最高的是多發(fā)部位結(jié)核患者(100%)，其次為結(jié)核性腹膜炎(84.2%)及淋巴結(jié)核(83.3%)，骨/關(guān)節(jié)結(jié)核陽(yáng)性率最低(54.5%)，多部位結(jié)核感染中有結(jié)核性心包炎合并胸膜炎2例，結(jié)核性胸膜炎合并腹膜炎2例，睪丸結(jié)核合并淋巴結(jié)核、肺結(jié)核1例，淋巴結(jié)核合并腎結(jié)核1例，結(jié)核性胸膜炎合并腹膜炎、心包炎1例。其它結(jié)核感染中包括有，皮膚結(jié)核1例，腸結(jié)核1例，結(jié)核性心包炎2例。具體見(jiàn)表1。

表1 87例肺外結(jié)核病患者的臨床特點(diǎn)及T-SPOT檢測(cè)結(jié)果

2 ELISPOT試驗(yàn)在肺外結(jié)核病診斷中的敏感性 評(píng)價(jià)肺外結(jié)核病患者中，ELISPOT方法檢測(cè)的陽(yáng)性率為73.6%，而病理診斷、PCR、痰涂片、結(jié)核抗體檢查的陽(yáng)性率分別為37.3%、3.8%、6.5%、14.6%，ELISPOT陽(yáng)性率顯著高于其它輔助檢查，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。為了提高PCR的陽(yáng)性率，部分結(jié)核性胸膜炎及結(jié)核性腹膜炎的患者同時(shí)采用了胸水及外周血檢測(cè)PCR。

表2 ELISPOT與其它各種方法檢查陽(yáng)性率的比較

3 ELISPOT與結(jié)核PCR試驗(yàn)的比較 51例肺外結(jié)核患者同時(shí)做了ELISPOT和病理檢測(cè)，將這兩種方法進(jìn)行了比較，ELISPOT方法陽(yáng)性率82.4%明顯高于病理方法陽(yáng)性率37.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

4 ELISPOT與結(jié)核抗體IgG的比較 41例肺外結(jié)核患者同時(shí)做了ELISPOT和結(jié)核抗體IgG，這兩種方法進(jìn)行了比較，ELISPOT方法陽(yáng)性率90.2%明顯高于結(jié)核抗體IgG的陽(yáng)性率性14.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

討 論

目前，肺外結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有細(xì)菌學(xué)檢查、結(jié)核抗體和抗原檢測(cè)、分子生物學(xué)診斷，其中細(xì)菌學(xué)檢查是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，常用的方法有涂片鏡檢和分枝桿菌培養(yǎng)，由于分枝桿菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，因此臨床開(kāi)展率低于涂片鏡檢。涂片鏡檢方法簡(jiǎn)單，但因肺外結(jié)核病合并肺結(jié)核的發(fā)病率不高，因此痰中找到結(jié)核桿菌的幾率低，而且痰菌檢測(cè)的檢出率本身不高，敏感性低，在本研究中痰涂片陽(yáng)性率僅6.5%。故該方法遠(yuǎn)不能滿足診斷需求。外科方法取組織病理檢測(cè)是確診肺外結(jié)核的另一種重要方法，本研究中用病理方法檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)37.3%，相對(duì)于痰涂片、結(jié)核抗體檢測(cè)及結(jié)核PCR檢測(cè)，敏感性較高，但因活檢為有創(chuàng)檢查，操作上要求高，不能廣泛應(yīng)用。

ELISPOT原理為將結(jié)核桿菌所特有，而卡介苗和其它分枝桿菌沒(méi)有的兩種抗原ESAT26和CFP10作為抗原刺激感染了結(jié)核分枝桿菌患者的記憶性T細(xì)胞增殖分化，釋放IFN-γ，通過(guò)檢測(cè)這些細(xì)胞來(lái)判別機(jī)體是否感染結(jié)核。該方法在活動(dòng)性結(jié)核感染和隱性結(jié)核感染中的敏感度和特異度很高，其應(yīng)用價(jià)值得到了廣泛認(rèn)可，但其在肺外結(jié)核中的應(yīng)用報(bào)道卻不多。本研究中收集了87例肺外結(jié)核病例，ELISPOT對(duì)肺外結(jié)核感染的敏感度為73.6%，與有關(guān)報(bào)道[2]中的敏感性79.8%相似，但低于Fan等[3]做的薈萃分析顯示的敏感度(90%)。我們將ELISPOT方法與其它常見(jiàn)的診斷方法進(jìn)行了比較，明顯高于病理檢測(cè)(37.3%)、痰涂片(6.5%)、抗體IgG檢測(cè)(14.6%)及PCR的檢測(cè)(3.8%)，說(shuō)明它是一種非常有效的診斷肺外結(jié)核病的有用的方法。

因肺外結(jié)核感染部位不同，臨床表現(xiàn)各不相同。本研究中骨/關(guān)節(jié)結(jié)核是肺外結(jié)核感染中所占比例最高，其次為結(jié)核性腹膜炎和結(jié)核性胸膜炎。與其它兩項(xiàng)研究一致的是不同肺外結(jié)核感染ELISPOT的敏感度是不同的[4，5]，但與他們研究不同的是各種肺外結(jié)核的敏感度不同。本研究中ELISPOT在結(jié)核性腦膜炎敏感度較低，為71.4%，而多部位結(jié)核感染者的敏感度最高，達(dá)100%，其次為結(jié)核性腹膜炎(84.2%)和淋巴結(jié)核(83.3%)，而發(fā)病最高的骨/關(guān)節(jié)部位結(jié)核感染者陽(yáng)性率最低，為54.5%。結(jié)核性胸膜炎的敏感度與Liao等的研究相同，均為73.7%。本研究中因本研究中無(wú)結(jié)核性心包炎及腸結(jié)核病例，故未能進(jìn)行比較。兩組研究中的敏感度不同可能與各種肺外結(jié)核病病例數(shù)量少，偏差相關(guān)，需擴(kuò)大樣本量來(lái)明確。

總之，肺外結(jié)核病中ELISPOT方法敏感度高，可作為肺外結(jié)核病診斷的重要檢測(cè)方法。不同部位結(jié)核感染中的敏感度不同，該方法在不同肺外結(jié)核感染中應(yīng)用價(jià)值仍需更大樣本的資料來(lái)確定。

參考資料

[1] Mehta PK, Raj A, Singh N，etal. Diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by PCR [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2012, 66 (1):20-36.

[2] Kim SH, Choi SJ, Kim HB,etal. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis [J]. Arch Intern Med, 2007, 167：2255-2259.

[3] Fan L,Chen Z,Hao XH,etal.Interferon-gamma release assays for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis:a systematic review and meta-analysis[J]. FEMS Immunol Med Micmbiol, 2012, 65 (3):456-466.

[4] Feng Y, Diao N, Shao L,etal. Interferon-gamma release assay performance in pulmonary and extrapulmonary tuberculosis [J]. PloS One, 2012, 7(3): e32652.

[5] Liao CH, Chou CH, Lai CC,etal. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-γ in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease [J]. J Infect, 2009,59: 402-404.

(收稿：2015-03-10)

*陜西省自然科學(xué)基金(2012JM4049)

結(jié)核/診斷 @ELISPOT

R52

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.035

▲西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

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