呂 燕 王祖忠 胡玲萍 黃 健 周 君張春丹 李 曄 蘇秀榕①

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2. 北京普析通用儀器責(zé)任有限公司 北京 101200)

多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)是聯(lián)苯苯環(huán)上的氫被氯取代而形成的多氯化合物, 對生物體有積蓄性毒害作用的一類持久性有機(jī)污染物的總稱, 被列為斯德哥爾摩公約中優(yōu)先控制的12類持久性有機(jī)污染物之一(穆季平, 2006; 蔣慧等, 2010),具有致畸、致癌和致突變性(Ross, 2004)。多氯聯(lián)苯是德國施米特和舒爾茨于1881年首先合成的, 美國于1929年最先開始生產(chǎn), 20世紀(jì)60年代中期, 全世界多氯聯(lián)苯的產(chǎn)量達(dá)到高峰, 年產(chǎn)約為10萬噸(陳春花,2010)。據(jù)估計, 全世界已生產(chǎn)的和使用中的PCB遠(yuǎn)超過100萬噸, 其中已有1/4—1/3進(jìn)入人類環(huán)境, 造成危害。雖然多氯聯(lián)苯等持久性有機(jī)污染物(POPs)已被國際禁止生產(chǎn)和使用, 但是由于當(dāng)時使用量大, 在環(huán)境中具有持久污染性, 至今仍能在環(huán)境樣品和食品中檢測到這些有機(jī)氯化合物(Chiaet al, 2006; 朱云海等,2012)。作為水產(chǎn)品生產(chǎn)大國, 目前我國海域水產(chǎn)品體內(nèi)多氯聯(lián)苯等的污染物的含量還是比較高的, 有些已嚴(yán)重超標(biāo)(甘居利等, 2009; 劉敏霞等, 2013)。這些污染物一般通過地表徑流、工業(yè)廢水和大氣沉降等各種途徑進(jìn)入生物體內(nèi), 即使?jié)舛葮O低, 在魚、貝類等低營養(yǎng)級生物的脂肪中被富集和放大, 不僅影響水生生物的生長、發(fā)育和繁殖, 也對食物鏈高層生物包括人類及其它高等動物形成危害(梁恕坤, 2009; 彭艷超等,2010; 李娜等, 2012)。目前可通過檢測貝類等水產(chǎn)品軟組織中富集的有機(jī)污染物含量來反映水體被污染的程度。因此, 對其在水產(chǎn)品中的檢測研究非常必要。

目前多氯聯(lián)苯的檢測方法主要有以下幾種: 免疫測定方法(陳寒玉等, 2011), 熒光檢測方法(Wanget al, 2010), 氣相色譜分析法(楊左軍等, 2011), 氣質(zhì)聯(lián)用分析法(王道瑋等, 2013), 液相色譜分析法(張琦等,2009; 邢紅等, 2015)等。這些方法儀器昂貴, 需要在穩(wěn)定的環(huán)境下進(jìn)行檢測, 而且樣品前處理比較復(fù)雜,不能滿足社會發(fā)展的需求。

本文主要采用電子鼻對青蛤軟組織中的多氯聯(lián)苯進(jìn)行快速檢測, 用線性判別式分析(LDA)、主成分分析(PCA)對結(jié)果進(jìn)行定性定量研究, 運用歐式距離、馬氏距離、判別函數(shù)法和相關(guān)性, 對不同濃度的PCB15海水所養(yǎng)殖的青蛤樣品進(jìn)行檢測和判別, 并利用HS-SPME-GC-MS檢測技術(shù)加以驗證(Ameeretal,2005; 徐亞丹等, 2006)。

1 材料與方法

1.1 材料

青蛤(Cyclina sinensis)購于寧波大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場。標(biāo)準(zhǔn)品 PCB15, 濃度為 10 μg/mL, 購自德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。手動SPME進(jìn)樣器、65μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(PDMS/DVB)涂層萃取頭,購于美國SUPELCO公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 青蛤購回后, 立即清洗去除殼上附著物, 剔除死亡及有破損的個體。按大小隨機(jī)分為5組。置于海水中暫養(yǎng)2 d, 為了避免排泄物及食物對實驗可能造成的影響, 暫養(yǎng)和前處理期間均不喂食。兩天更換一次海水, 同時除去死亡個體。水溫在18—25°C, 氣泵加氧。

實驗組根據(jù)海水中PCB15濃度分為5組, 每組50只青蛤, PCBs濃度依次為0、0.005、0.1、0.5和1μg/L;在此期間, 每兩天更換海水一次, 每天查看、記錄死亡情況, 并及時去除死亡個體和清理殼體附著物。當(dāng)青蛤長時間保持開殼狀態(tài), 用細(xì)玻棒碰觸殼體和軟組織而無反應(yīng)者, 可判斷為已死亡。整個實驗過程持續(xù)8d, 依次在處理72 h和144 h時取樣測定, 每次平均取樣10只。用于電子鼻和氣質(zhì)聯(lián)用測定。

用手術(shù)刀將五組青蛤直接撬殼, 取出軟組織, 剪碎, 稱0.4 g放入15 mL螺紋樣品瓶中, 擰緊瓶蓋。每組5個平行, 用于電子鼻及后續(xù)氣質(zhì)聯(lián)用的測定。

1.2.2 電子鼻檢測

檢測: 將各樣品瓶在55—60°C恒溫水浴中加熱保溫30min, 室溫下冷卻15min, 使瓶中頂空氣體平衡后利用電子鼻(PEN 3, Airsense公司, 梅克倫堡州, 德國)檢測, 數(shù)據(jù)采集時間為200s, 清洗時間為300s, 進(jìn)氣量為300mL/min。

數(shù)據(jù)分析: 運用電子鼻配套的WinMuster軟件對電子鼻采集的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)以及線性判別分析( LDA)。

1.2.3 HS-SPME-GC-MS測定

萃取: 將萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口 250°C, 老化0.5h后, 插入樣品瓶于55°C水浴吸附30min, 然后用氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS聯(lián)用儀, 美國安捷倫科技公司,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)進(jìn)樣口于 220°C解吸附5min, 啟動氣質(zhì)聯(lián)用儀采集數(shù)據(jù)。

色譜條件: DB-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×2.5 μm); 載氣He, 流速1 mL/min; 不分流模式進(jìn)樣,進(jìn)樣時間3 min, 恒流1 mL/min; 進(jìn)樣口溫度: 220°C,程序升溫: 起始柱溫120°C保持4 min, 15°C/min 升至280°C, 保留3 min。

質(zhì)譜條件: 離子源為電子轟擊源(EI), 電離電壓70 eV, 離子源溫度250°C, 傳輸線溫度為280°C, 掃描范圍45—450 u。

數(shù)據(jù)分析: 通過計算機(jī)檢索NIST譜庫相互匹配進(jìn)行定性分析, 對譜庫中化合物相似度高于80的組分加以標(biāo)定, 按照峰面積歸一化法計算各組分相對百分含量(何紅萍等, 2013a, b)。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻檢測結(jié)果

2.1.1 青蛤PCB15的模版建立 圖1a和圖1b為處理72h和144h青蛤軟組織中PCB15檢測結(jié)果, 其中每個橢圓代表一個所檢測到的PCB15濃度, 橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)分別表示在LDA轉(zhuǎn)換中得到的LD1(判別函數(shù)1)和LD2(判別函數(shù)2)以及PCA轉(zhuǎn)換中得到的PC1(第一主成分)和PC2(第二主成分)的貢獻(xiàn)率。從圖1a可以看出, 第一判別式函數(shù)方差貢獻(xiàn)率LD1與第二判別式函數(shù)方差貢獻(xiàn)率LD2分別為54.44%和33.65%,總貢獻(xiàn)率為88.09%; 從圖1b看出, 第一、二主成分PC1、PC2分別為75.29%和17.25%, 總貢獻(xiàn)率達(dá)到92.54%?？梢? PCA的分析效果優(yōu)于LDA, 具有更高的分辨率。

圖2a、圖2b分別為144 h后PCB15在青蛤軟組織中殘留的LDA、PCA分析圖。從圖2a可以看出, 樣品處理144h后, 第一判別式函數(shù)方差貢獻(xiàn)率LD1與第二判別式函數(shù)方差貢獻(xiàn)率LD2分別為78.82%和10.24%,總貢獻(xiàn)率為89.06%; 從圖2b看出, 第一、二主成分PC1、PC2分別為75.29%和17.25%, 總貢獻(xiàn)率達(dá)到92.54%。PCA的分析效果優(yōu)于LDA, 不同濃度PCB15在PCA分析圖中能夠完全分開。在LDA分析圖中呈現(xiàn)有一定的聚類特性, 空白組與0.05μg/L組在空間分布上有微小的交集, 當(dāng)濃度達(dá)到0.1μg/L以上時區(qū)分效果很明顯。PCA的分辨效果明顯優(yōu)于LDA, 電子鼻的PCB15濃度的檢測限最低為0.05μg/L。

圖3a、圖3b是電子鼻采集到的不同時間處理后PCB15在青蛤軟組織中殘留的LDA、PCA分析圖, 總貢獻(xiàn)率分別為90.99%、88.28%, 第二主成分貢獻(xiàn)率PC2明顯升高, 達(dá)到23.14%。可以看出不同濃度組基本沒有交集, 還是能夠明顯區(qū)分開來。說明PCB15濃度隨著作用時間的延長, 氣味會發(fā)生明顯變化, 但是濃度仍可以區(qū)分。綜合圖1、圖2和圖3的分析結(jié)果, 青蛤的氣味雖受作用時間影響, 但是還在一個氣味區(qū)域中。因此, 無論作用時間如何變化, 電子鼻都能夠準(zhǔn)確地識別出青蛤軟組織中PCB15的濃度。

圖1 處理72h的青蛤軟組織中PCB15的LDA和PCA分析結(jié)果Fig.1 LDA and PCA score plots of PCB15 in 72h from C. sinesis soft tissue a. LDA分析圖; b. PCA分析圖

圖2 處理144h的青蛤軟組織中PCB15的LDA和PCA分析結(jié)果Fig.2 LDA and PCA score plots of PCB15 in 144h from C. sinensis soft tissue a. LDA分析圖; b. PCA分析圖

圖3 青蛤PCB15的LDA和PCA分析模板Fig.3 LDA and PCA score plots of PCB15 in C. sinensis a. LDA分析圖; b. PCA分析圖

2.1.2 青蛤PCB15模版的驗證和各個濃度的識別 分別取不同濃度下PCB15海水中培養(yǎng)108h的青蛤樣品,用判別函數(shù)分析(DFA)法驗證模板的準(zhǔn)確性, 由圖4—圖8可以看出, 不同種類的待測樣品的氣味曲線穿過PCB15模板各濃度到達(dá)和自己相近的濃度終點,經(jīng)過電子鼻分析, 對待測樣品進(jìn)行歸類以及判定, 找到樣品所屬的數(shù)據(jù)區(qū)域(圖4), 從而判定待測樣品所屬濃度。歐氏距離、相關(guān)性、判別函數(shù)法、馬氏距離等方法的鑒別率分別為100%、92%、96%、92%。四種方法總的鑒別率均達(dá)到90%以上, 能夠較準(zhǔn)確地對電子鼻結(jié)果進(jìn)行驗證(見表1)。

圖4 空白組的識別結(jié)果Fig.4 Validation results of control check

圖5 PCB15濃度為0.05μg/L的識別結(jié)果Fig.5 Validation results of 0.05μg/L

圖6 PCB15濃度為0.1μg/L的識別結(jié)果Fig.6 Validation results of 0.1μg/L

圖7 PCB15濃度為0.5μg/L的識別結(jié)果Fig.7 Validation results of 0.5μg/L

圖8 PCB濃度為1μg/L的識別結(jié)果Fig.8 Validation results of 1μg/L

表1 4種模型對PCB15濃度識別結(jié)果Tab.1 Identification results of PCB15 concentrations in four models

2.2 GC-MS檢測結(jié)果

青蛤軟組織勻漿中添加不同濃度的PCB15, 測定各濃度相應(yīng)的峰面積并以其為縱坐標(biāo), 以濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中, 回歸方程是y=7248.32x–135.09,R2= 0.9998。表2是根據(jù)方程所得的定量值、相對誤差和回收率。可以看出, 在各濃度水平下, 相對誤差在3.8%—18%, 回收率保持在85%—118%之間。

表3是青蛤軟組織中PCB15作用一段時間后的GC-MS檢測結(jié)果, 通過外標(biāo)法定量。從表3可以看出,在PCBs濃度低于0.1μg/L的海水中養(yǎng)殖的青蛤軟組織中沒有檢測到PCB15。

表2 GC-MS檢測方法的回收率Tab.2 The recovery rate of GC-MS detection method

表3 青蛤PCBs的GC-MS檢測結(jié)果Tab.3 The detection results of GC-MS for PCBs in C. sinensis

3 討論

電子鼻能夠快速檢測青蛤軟組織中的多氯聯(lián)苯,檢測限可以達(dá)到 0.05μg/L, 檢測時間僅用 10min。采用LDA和PCA分析, 建立多氯聯(lián)苯的濃度識別模板;在處理方法相同的情況下, PCB15作用72 h組的PCA的分析效果優(yōu)于LDA, 具有更高的分辨率; 而144 h組的 PCA的分析效果同樣優(yōu)于 LDA, 區(qū)分效果較72h組的更好。說明處理時間對電子鼻更高效的檢測青蛤軟組織中的多氯聯(lián)苯有重要作用, 隨著處理時間的延長, 兩種方法的總貢獻(xiàn)率越高, 辨別效果越好,推測這可能與貝類對海水中多氯聯(lián)苯的富集作用有關(guān)。運用歐氏距離、馬氏距離、判別函數(shù)法和相關(guān)性對樣品中 PCB15濃度進(jìn)行鑒別驗證, 四種方法總的鑒別率也均達(dá)到 90%以上, 可以較準(zhǔn)確地對樣品進(jìn)行檢測。

在電子鼻檢測青蛤軟組織多氯聯(lián)苯時, PCA分析效果明顯優(yōu)于LDA分析。PCA主要是從特征的協(xié)方差角度去找到比較好的投影方式, 因此不同濃度組的樣本能夠有明顯差異, 區(qū)分效果較為明顯。而LDA更多的是考慮了標(biāo)注, 即希望投影后不同類別之間數(shù)據(jù)點的距離更大, 同一類別的數(shù)據(jù)點更緊湊。概括來說, PCA選擇樣本點投影具有最大方差, LDA選擇分類性能最好。LDA的缺點是抗干擾容錯能力差, 不能保證最大程度排除青蛤在培養(yǎng)過程中環(huán)境的變化。而當(dāng)樣本數(shù)據(jù)較多, 需要驗證判別未知樣品歸類或者濃度時, 考慮到標(biāo)注的 LDA分析分類效果要優(yōu)于PCA分析。因此兩者各有利弊, 應(yīng)該結(jié)合使用(張亮等, 2013)的分析方法。

用氣質(zhì)聯(lián)用分析青蛤軟組織中的多氯聯(lián)苯濃度時發(fā)現(xiàn): 青蛤在海水中PCB15濃度為0.5μg/L以上時才能在軟體中檢測到。HS-SPME-GC-MS檢測方法相對誤差在3.8%—18%的區(qū)間內(nèi)。而電子鼻歐氏距離、相關(guān)性、判別函數(shù)法、馬氏距離等方法的鑒別率均達(dá)到 90%以上, 與 HS-SPME-GC-MS的檢測結(jié)果相比,效果更好。在實際應(yīng)用中, 電子鼻的最低檢出限0.05μg/L要比GC-MS的0.5μg/L要低, 說明電子鼻適用于貝類產(chǎn)品中的多氯聯(lián)苯污染的快速檢測。為了提供更可靠的依據(jù), 可以把電子鼻檢測與 GC-MS方法結(jié)合起來, 分析出海水中不同有害物質(zhì)存在下貝類的特征揮發(fā)性物質(zhì)及其所占的比例, 從而為貝類監(jiān)督檢驗提供參考。

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