韋一凡 郇 麗 牛建峰 何林文 黃愛優(yōu)張寶玉 林阿朋 王廣策①

(1. 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國科學(xué)院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs), 也稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域, 是一種可以自發(fā)跨膜進(jìn)入細(xì)胞的多肽(Lindgrenet al, 2000)。這種蛋白跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象最初是在研究 HIV-1病毒上的 Tat蛋白時(shí)被發(fā)現(xiàn)的(Frankelet al, 1988)。CPPs能夠介導(dǎo)熒光素、GFP、DNA、siRNA以及質(zhì)粒等進(jìn)入細(xì)胞, 該方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在動物細(xì)胞的研究方面(Guptaet al, 2005;Turneret al, 2005; Crombezet al, 2008)。目前CPPs關(guān)于植物細(xì)胞的應(yīng)用較少(Parket al, 2000; M?eet al,2005; Chughet al, 2009)。在藻類方面, 現(xiàn)有的CPPs研究主要集中在微藻(Liuet al, 2008; Hymanet al,2012; Sureshet al, 2013)。Hyman 等(2012)應(yīng)用細(xì)胞穿膜肽八聚精氨酸和九聚精氨酸, 成功地將小分子、蛋白質(zhì)以及酶轉(zhuǎn)導(dǎo)入野生型的萊茵衣藻。與傳統(tǒng)的外源物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)方法(如基因槍法)相比, 應(yīng)用細(xì)胞穿膜肽不僅能夠避免制備原生質(zhì)體, 而且還具有操作簡易、可規(guī)?；?、不會造成細(xì)胞物理損傷等優(yōu)點(diǎn)。然而, 如今尚不清楚已成功應(yīng)用于微藻的CPPs是否能夠同樣應(yīng)用于大型海藻。大型海藻與微藻的結(jié)構(gòu)有很大區(qū)別,前者具有更厚的細(xì)胞壁, 多糖等成分含量更加豐富,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)也更復(fù)雜(Popperet al, 2011)。有些大型海藻如海帶(Laminaria japonica)富含膠質(zhì), 對外源物質(zhì)的轉(zhuǎn)入有更強(qiáng)的阻礙作用。目前還未見CPPs應(yīng)用于大型海藻的相關(guān)報(bào)道。

作者選取三種具有代表性的大型海藻, 分別是滸苔(Ulva prolifera)、紫菜(Porphyra yezoensis)和海帶(Laminaria japonica), 應(yīng)用細(xì)胞穿膜肽九聚精氨酸(R9)對其進(jìn)行細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示九聚精氨酸可以高效的共價(jià)連接熒光素導(dǎo)入三種大型海藻細(xì)胞。與此同時(shí), 對細(xì)胞穿膜肽處理后的三種大型海藻進(jìn)行光合作用效率的檢測, 結(jié)果表明細(xì)胞穿膜肽 R9對三種大型海藻的光合效率均無影響。因此, 對于大型海藻來說, 細(xì)胞穿膜肽是一種安全高效的分子手段。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)中的大型海藻材料(滸苔、條斑紫菜葉狀體、條斑紫菜絲狀體、海帶孢子體、海帶雌雄配子體)均來自于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為18°C, 光照為60 μmol photons/(m2·s), 光暗周期設(shè)為 12h︰12h。

細(xì)胞穿膜肽九聚精氨酸(RRRRRRRRR, R9)及異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的九聚精氨酸(FITC-R9)合成于吉爾生化有限公司(GL Biochem, China), 采用ABI433自動多肽合成儀,依據(jù)Fmoc標(biāo)準(zhǔn)固相合成法, 并用HATU作為肽偶聯(lián)試劑(Athertonet al, 1989)。單獨(dú)的異硫氰酸熒光素(FITC)購于Sigma-Aldrich有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞穿膜肽R9導(dǎo)入大型海藻 選取健康的藻體, 用吸水紙將表面海水吸干, 稱取兩份等重的藻絲, 分別為實(shí)驗(yàn)組和對照組, 備用; 取兩只1.5 mL的Eppendorf離心管, 將兩組藻體分別轉(zhuǎn)移至兩只離心管中; 加入500 μL的PBS溶液, 5000 r/min離心1 min,傾去上清; 在避光室溫條件下, 在實(shí)驗(yàn)組中加入500 μL濃度為50 μmol/L的FITC-R9溶液, 同時(shí), 在對照組中加入500 μL濃度為50 μmol/L的FITC溶液; 室溫避光條件下處理10 min; 10 min后, 實(shí)驗(yàn)組和對照組均5000 r/min離心1 min, 傾去上清; 兩組均加入500 μL的PBS, 5000 r/min離心1 min, 傾去上清, 重復(fù)三次, 得到處理完成的藻體, 備用。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察拍照 將處理后藻體置于載玻片上, 加入適量 PBS溶液, 蓋上蓋玻片,對蓋玻片周邊進(jìn)行封片; 將已制成片的玻片倒置放在激光共聚焦顯微鏡的載物臺上; 設(shè)置參數(shù), 選取雙通道, 分別應(yīng)用488 nm和663 nm的激發(fā)光波長。對于實(shí)驗(yàn)組和對照組, 所有的設(shè)置保持一致, 選取合適的視野, 觀察拍照。

1.2.3 CPPs導(dǎo)入大型海藻后光合效率變化的測定選取狀態(tài)良好的滸苔、紫菜和海帶, 每種藻取三等份;配制等量的PBS溶液, 50 μmol/L的R9溶液, 50 μmol/L的FITC-R9溶液, 對藻體進(jìn)行處理, 處理時(shí)間為10 min;藻體暗適應(yīng) 5—10 min, 將 Dual-PAM-100熒光儀與裝有相應(yīng)配置軟件的電腦相連, 在室溫下測量 PSII的葉綠素?zé)晒?Chl fluorescence of PSII)和P700的氧化還原狀態(tài)(the redox state of P700)。具體的設(shè)置參數(shù)為: 測量光來自620 nm波長的發(fā)光二極管(LED); 光化光來自 460 nm的 LED, 光強(qiáng)設(shè)置為 100 mmol photons/(m2·s), 持續(xù)時(shí)間為 5 min; 飽和光脈沖光強(qiáng)為 10000 mmol photons/(m2·s), 持續(xù)時(shí)間為 300 ms。將暗適應(yīng)后的藻體夾在Dual-PAM的測量探頭上, 平衡后, 開始測量; 測得一系列參數(shù)后由Dual-PAM軟件推導(dǎo)得出最大量子產(chǎn)率Fv/Fm、光系統(tǒng)I的電子傳遞速率 ETR(I)以及光系統(tǒng) II的電子傳遞速率ETR(II)。滸苔、紫菜和海帶每一組均有三個(gè)平行樣品, 所有樣品測量時(shí)的設(shè)置參數(shù)均一致。測量后的樣品, 等待3 h后, 按照上述步驟, 重新測量一遍。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPPs導(dǎo)入大型海藻

如圖1所示, 熒光標(biāo)記的R9能夠進(jìn)入三種大型海藻細(xì)胞。其中圖中紅色部分代表藻體的葉綠體自發(fā)熒光, 綠色部分則是細(xì)胞穿膜肽上的熒光標(biāo)記在488 nm激光激發(fā)下所顯示的顏色。由圖中可以看出, 紫菜的葉狀體(圖1a)和海帶的雌配子體(圖1b)的細(xì)胞穿膜肽作用效率最高, 部分 CPPs被細(xì)胞壁阻礙在細(xì)胞外,大部分的 CPPs進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi), 定位在葉綠體周圍。經(jīng)CPPs處理后的滸苔藻體(圖1e)顯示出明顯的綠色熒光, 仔細(xì)觀察后發(fā)現(xiàn)大部分綠色熒光位于細(xì)胞壁上, 也就是說在作用于滸苔時(shí), 小部分的 CPPs進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)部, 大部分被阻隔在外。對照組單獨(dú)的FITC處理三種大型海藻, 沒有顯示綠色熒光, 說明單獨(dú)的FITC不能進(jìn)入大藻細(xì)胞。

考慮到大型海藻不同生活史狀態(tài)下細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)可能有所不同, 作者對不同生活史狀態(tài)下的紫菜和海帶進(jìn)行了細(xì)胞穿膜肽導(dǎo)入。在紫菜方面, 雖然其葉狀體(圖1a)的細(xì)胞內(nèi)部可觀察到明顯綠色熒光, 但是其絲狀體的細(xì)胞穿膜肽作用效率偏低。如圖1d所示, 大部分的絲狀體細(xì)胞是被綠色熒光所包圍著的,真正進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的比例較少, 這間接說明紫菜葉狀體和絲狀體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)可能存在一定差異。在海帶方面, 考慮到不同性別的細(xì)胞可能會存在細(xì)胞壁的差異或者存在不同的內(nèi)在轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制, 作者對海帶的雌、雄配子體的CPPs轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進(jìn)行了對比。結(jié)果顯示, 與雌配子體(圖 1b)相比, 海帶雄配子體(圖 1c)的 CPPs轉(zhuǎn)導(dǎo)效率要低的多, 綠色熒光絕大多數(shù)分布在雄配子體的外圍, 幾乎沒能進(jìn)入細(xì)胞。這種現(xiàn)象可能是由于海帶雌配子體的細(xì)胞壁滲透性比精子細(xì)胞的更大, 或者可能是卵細(xì)胞存在更為高效的內(nèi)部運(yùn)輸機(jī)制。與此同時(shí), 海帶的孢子體也被檢測(圖 1f),圖中顯示海帶孢子體的表皮細(xì)胞有著少量的CPPs攝入, 這可能是由于海帶的孢子體含有大量的膠質(zhì), 從而形成了更加強(qiáng)大的屏障, 阻礙外源物質(zhì)的進(jìn)入。

細(xì)胞穿膜肽進(jìn)入動物細(xì)胞后有向細(xì)胞核移動的趨勢(Frankelet al, 1988), 這在大型海藻中也有所體現(xiàn)。CPPs處理紫菜的葉狀體后, 細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光趨向集中于一點(diǎn)(圖1a), 這一點(diǎn)有可能就是紫菜細(xì)胞核的位置。在海帶的雌配子體中也能夠觀察到類似的現(xiàn)象(圖 1b)。

2.2 CPPs處理大藻后的光合作用效率測定

Fv/Fm代表著光系統(tǒng)II的最大量子產(chǎn)率, 它是用來評價(jià)植物體光合作用表現(xiàn)的一個(gè)敏感參數(shù), 當(dāng)植物體受到外界脅迫時(shí),Fv/Fm的值會急劇下降(Maxwellet al, 2000)。ETR(I)和 ETR(II)分別代表光系統(tǒng)I和II的電子傳遞速率, 反映了兩個(gè)光系統(tǒng)的活性。

由圖 2可知, 滸苔經(jīng)細(xì)胞穿膜肽 R9和FITC-R9處理10 min后, 實(shí)驗(yàn)組與對照組的Fv/Fm相比沒有太大差別(圖 2a); R9處理后的 ETR(I)有略微的下降, 但與對照組相比沒有顯著性差異;FITC-R9處理后的 ETR(I)有略微上升, 分析原因可能是由于熒光素在 Dual-PAM 測量過程中被激發(fā)顯示出熒光, 該部分光被藻體吸收后, 增強(qiáng)了光系統(tǒng) I的電子傳遞速率。ETR(II)則一直保持恒定, 無論是 R9處理還是 FITC-R9處理, ETR(II)的值都沒有變化(圖2b)。

為了驗(yàn)明較長處理時(shí)間后細(xì)胞穿膜肽是否對大型海藻光合作用有影響, 作者在3 h后對已用R9以及FITC-R9處理后的滸苔再次進(jìn)行光合效率測量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 2c以及圖 2d所示, 實(shí)驗(yàn)組和對照組的Fv/Fm值基本保持一致, ETR(I)和 ETR(II)也都相對恒定。這說明一定濃度的R9對滸苔的光合作用效率基本沒有負(fù)面影響。

圖1 熒光標(biāo)記的九聚精氨酸轉(zhuǎn)導(dǎo)大型海藻細(xì)胞Fig.1 Translocations of fluorescent labeled nona-arginine on macroalgaea. 紫菜葉狀體; b. 海帶雌配子體; c. 海帶雄配子體; d. 紫菜絲狀體; e. 滸苔; f. 海帶孢子體

圖2 滸苔經(jīng)細(xì)胞穿膜肽R9以及FITC-R9導(dǎo)入后光合效率的變化Fig.2 Changes in photosynthetic efficiency of U. prolifera after being treated with R9 and FITC-R9a. 處理后10 min滸苔的Fv/Fm變化; b. 處理后10 min滸苔ETR(I)和ETR(II)的變化; c. 處理后3 h滸苔的Fv/Fm變化; d. 處理后3 h滸苔ETR(I)和 ETR(II)的變化

如圖3a所示, 經(jīng)由R9和FITC-R9處理10 min后的紫菜Fv/Fm與對照組相比沒有顯著性變化, 有略微的上升。ETR(I)同樣有略微上升的趨勢, 而ETR(II)則保持恒定(圖3b)。3 h后重新測量的結(jié)果表明, R9處理的紫菜Fv/Fm與對照組相比仍然是略微偏高, 而FITC-R9處理的紫菜與對照組相比則略有下降的趨勢, 可能是由于3 h后熒光素已發(fā)生部分淬滅。除此之外, 無論是 R9處理還是 FITC-R9處理, 與對照組相比, ETR(I)和ETR(II)基本上都沒有發(fā)生變化。

圖3 細(xì)胞穿膜肽R9以及FITC-R9導(dǎo)入紫菜后的光合作用效率變化Fig.3 Changes of photosynthetic efficiency of P. yezoensis after being treated with R9 and FITC-R9a. 處理后10 min 紫菜的Fv/Fm變化; b. 處理后10 min紫菜ETR(I)和ETR(II)的變化; c. 處理后3 h紫菜的Fv/Fm變化; d. 處理后3 h紫菜ETR(I)和ETR(II)的變化

海帶的結(jié)果基本上與滸苔和紫菜保持一致(圖4),無論是處理10 min還是3 h, 與對照組相比, R9處理以及FITC-R9處理后海帶的Fv/Fm都沒有下降(圖4a,圖4c), ETR(I)和ETR(II)的值也沒有受到太大影響。不過, 與處理10 min的相比, 海帶的ETR(I)和ETR(II)在3 h后整體有顯著下降, 這可能是因?yàn)楹П旧淼目鼓嫘暂^弱, 時(shí)間較長后其本身的光合作用活性就會有下降, 而不是由于CPPs引發(fā)的光系統(tǒng)活性降低。因此, 與對照組相比, 實(shí)驗(yàn)組的 ETR(I)和 ETR(II)仍沒有顯著性變化。

總的來說, 細(xì)胞穿膜肽 R9不會對這三種大型海藻產(chǎn)生脅迫效應(yīng), 經(jīng)R9處理后的Fv/Fm不會下降。同時(shí), R9對其光系統(tǒng)的活性也不會有負(fù)面影響。這間接證明了細(xì)胞穿膜肽R9對大型海藻沒有毒害作用。

3 討論

細(xì)胞穿膜肽具有極強(qiáng)的穿透能力, 目前該特性已被廣泛的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(Polyakovet al, 2000;Rothbardet al, 2000; Wadiaet al, 2005)。有些人為設(shè)計(jì)的 CPPs甚至可以穿透滲透性極低的血腦屏障, 從而將藥物輸送到特殊的靶位點(diǎn)(Costantinoet al,2005)。對于高等植物或者藻類, CPPs則需要穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜這兩層屏障。因此, CPPs的穿膜效率與藻體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系, 細(xì)胞壁越厚, 對于CPPs的阻礙效果越強(qiáng)。比如說, 與絲狀體相比, 紫菜的葉狀體的細(xì)胞壁更薄。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明紫菜葉狀體相對于絲狀體能夠攝入更多的CPPs。另外, 海帶的雌配子體比雄配子體的 CPPs轉(zhuǎn)導(dǎo)效率要高, 可能說明雌配子體細(xì)胞壁的滲透性比雄配子體要大。由此看來, 細(xì)胞穿膜肽有助于研究比較大型海藻不同世代的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu), 主要著重于研究其滲透性。

圖4 細(xì)胞穿膜肽R9以及FITC-R9導(dǎo)入海帶后的光合作用效率變化Fig.4 Changes of photosynthetic efficiency of L. japonica after being treated with R9 and FITC-R9a. 處理后10 min海帶的Fv/Fm變化; b. 處理后10 min海帶ETR(I)和ETR(II)的變化; c. 處理后3 h海帶的Fv/Fm變化; d. 處理后3 h海帶ETR(I)和ETR(II)的變化

已有的研究表明, CPPs對動物細(xì)胞和植物細(xì)胞基本上無毒性(Vivèset al, 1997; Unnamalaiet al, 2004;Changet al, 2005)。本文作者測量了CPPs處理后大型海藻的光合作用效率的變化, Dual-PAM 的結(jié)果表明CPPs對大型海藻的光合作用效率沒有負(fù)面影響, 也就是說 CPPs對大型海藻基本無毒性, 從而能夠安全高效的應(yīng)用于大型海藻的研究。后續(xù)的研究可以利用CPPs攜帶各類生物小分子或大分子進(jìn)入大型海藻,將原本無法滲透進(jìn)入藻細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入大型海藻, 發(fā)揮其生物學(xué)功能。

目前關(guān)于 CPPs的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍存爭議, 然而現(xiàn)有研究表明無論是動物細(xì)胞還是高等植物細(xì)胞, CPPs都能夠適用, 具有普適性。CPPs在藻類特別是大型海藻方面的研究較為匱乏, 其介導(dǎo)外源物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入大型海藻的特性, 將來應(yīng)該有更為廣闊的應(yīng)用前景。

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