丁滌非，胡 凱，方 萍，韓曉婷，陸籠輝

胃癌是世界范圍內(nèi)引起惡性腫瘤死亡的主要疾病。最新統(tǒng)計(jì)［1］顯示，在2003-2007年中國胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第2位，男性高于女性;同期胃癌死亡率居惡性腫瘤死因第3 位，男性亦高于女性。早期胃癌多無癥狀，或者僅有一些非特異性消化道癥狀，因此僅憑臨床癥狀，診斷早期胃癌十分困難。進(jìn)展期胃癌患者生存率低，復(fù)發(fā)率高［2-4］。第10 號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶和張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一種抑癌基因，近年來研究［5］發(fā)現(xiàn)，該基因的缺失表達(dá)與人類多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PTEN 抑癌基因，其表達(dá)的蛋白具有雙磷酸酶活性，可以通過脫磷酸作用調(diào)節(jié)多種信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，PTEN 可通過使磷酸肌醇(PI3K)去磷酸化，拮抗PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的增殖，還可以通過下調(diào)黏著斑激酶(FAK)的活性抑制細(xì)胞的黏附，浸潤和轉(zhuǎn)移，通過促分裂原活化蛋白(MAPK)途徑抑制細(xì)胞的分化。人環(huán)氧化酶(cyclooxygenase cyclooxygenase-2，COX-2)基因定位于1號(hào)染色體q25.2～25.3 上，由10 個(gè)外顯子和9 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，為編碼603～604 個(gè)氨基酸組成的多肽，被認(rèn)為是“快速反應(yīng)基因”。COX-2 具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、抑制免疫功能、誘導(dǎo)腫瘤血管形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移等功能［6］。本研究用免疫組化法聯(lián)合檢測胃癌組織中兩者的表達(dá)，以探討其表達(dá)水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，及胃癌中COX-2 與PTEN 的表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 病理資料 隨機(jī)選取從2009年5月-2011年5月我院手術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為胃癌的資料80 例，癌旁組織80 例，男55例，女25 例，年齡35～78 歲，平均年齡(53.4 ±3.4)歲。年齡≥50 歲52 例，＜50 歲28 例。根據(jù)美國惡性腫瘤聯(lián)合委員會(huì)(AJCC 第7 版)2011年NCCN 指南胃癌PTNM 分期法進(jìn)行臨床分期:Ⅰ期+Ⅱ期(28 例)、Ⅲ期(52 例)，無Ⅳ期患者。28例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，52 例淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移。按分化程度分成三型:高中分化30 例，低分化50 例。標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，分別作COX-2 HE 染色、PTEN HE 染色。所有胃癌患者術(shù)前均未接受放化療，均為第一次手術(shù)。癌旁組織為正常組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)Elivision 方法。鼠抗人COX-2 單克隆抗體、鼠抗人PTEN 單克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)公司，Elivision 檢測試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。免疫組化染色嚴(yán)格按照Elivision試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行，陽性對(duì)照選用已知陽性胃癌切片，用PBS 代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定 采用SP 免疫組織化學(xué)方法檢測，均設(shè)陰性及陽性對(duì)照，觀察陽性反應(yīng)采用雙盲法。PTEN免疫組化染色陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒。兩位病理科醫(yī)師隨機(jī)選擇10 個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分率，陽性細(xì)胞的百分率＜10%為陰性(－);百分率＞10%為陽性，結(jié)果拍攝成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s 確切概率分析;PTEN 和COX2 的相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析;取P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本組80 例胃癌中PTEN 陽性表達(dá)有33 例，陽性表達(dá)率為41.3%，癌旁組織陽性表達(dá)有64 例，陽性表達(dá)率為80%，差異具有顯著性(P＜0.05);80 例胃癌中COX-2 陽性表達(dá)有56例，陽性表達(dá)率為70%，在癌旁組織陽性表達(dá)有12 例，陽性表達(dá)率為6%，差異具有顯著性(P＜0.05)。

2.1 胃癌組織中PTEN、COX-2 與臨床病理間的指標(biāo)關(guān)系見表1、表2。

表1 PTEN 與臨床病理間的指標(biāo)關(guān)系

2.2 PTEN 和COX-2 在胃癌中的相關(guān)性 80 例胃癌組織中PTEN 和COX-2 蛋白雙陽性表達(dá)15 例，雙陰性表達(dá)4 例，PTEN(+)COX-2(－)18 例，PTEN(－)COX-2(+)43 例，兩者的表達(dá)強(qiáng)度呈明顯負(fù)相關(guān)(r=－0.508，P=0.003＜0.05)，即胃癌組織中COX2 表達(dá)愈強(qiáng)，PTEN 蛋白表達(dá)就愈弱，反之亦然。見圖1～圖6。

表2 COX-2 與臨床病理間的指標(biāo)關(guān)系

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，激活原癌基因和腫瘤抑制基因失活，和其他或更多的分子水平上的變化密切相關(guān)。PTEN 是1997年Tamura M 等［7］克隆到的抑癌基因，其位于染色體人類10 號(hào)染色體的長臂(10q23.3)上。腫瘤抑制因子PTEN 是具有序列相似性的細(xì)胞骨架蛋白張力磷酸酶。PTEN 基因過表達(dá)抑制細(xì)胞遷移，而反義PTEN 促進(jìn)轉(zhuǎn)移。同時(shí)具有磷酸酪氨酸磷酸酶和雙重特異性磷酸酶是PTEN 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)同時(shí)有磷酸酪氨酸磷酸酶和雙特異性磷酸酶是PTEN 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。研究顯示PTEN 的抑癌機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止和程序性細(xì)胞死亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘連、遷移和分化，抑制血管的生成［8］。研究顯示［9］PTEN 可通過粘著斑激酶(focal adhesion kinase(FAK))參與PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)途徑，導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。PTEN 抑癌活動(dòng)在很大程度上取決于其脂質(zhì)磷酸酶活動(dòng)，反義PI3K/AKT 激活。而在許多腫瘤疾病中有PTEN 的基因的突變，如甲狀腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等。

近年來COX-2 在多種腫瘤中表達(dá)情況受到關(guān)注，許多研究［10］證實(shí)COX-2 和腫瘤血管生成之間存正相關(guān)關(guān)系。COX-2 能增加VEGF 的表達(dá)、整合素調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞，纖溶膠原酶激活因子，間質(zhì)膠原酶和各種蛋白水解酶活化因子表達(dá)式，促進(jìn)細(xì)胞外的退化，增加微血管通透性，和監(jiān)管活動(dòng)的HIF-1α 和Survivin，KGF 協(xié)同促進(jìn)胃癌血管生成［11］，從而為腫瘤及轉(zhuǎn)移提供適合的基礎(chǔ)口侵潤及轉(zhuǎn)移。COX-2 通常被發(fā)現(xiàn)在許多類型的腫瘤組織包括食道、胃、結(jié)腸、肝臟、膽道系統(tǒng)、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌［12］?，F(xiàn)研究已從多方面證明COX－2 在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移密切有關(guān)。COX-2 可以通過刺激腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡和抑制人體的免疫功能，可以通過促進(jìn)血管形成參與轉(zhuǎn)移癌前病變的腫瘤。王曉英等的研究表明COX-2 和PTEN 基因表達(dá)與胃癌浸潤程度高度相關(guān)性，可能具有評(píng)價(jià)胃癌浸潤程度的潛在價(jià)值［13］。

圖1 COX－2 在癌組織中的陽性表達(dá)(Elivision 法×100)

圖2 COX-2 在癌組織中的陽性表達(dá)(Elivision 法×400)

圖3 COX－2 在癌旁組織中的陰性表達(dá)(Elivision 法×400)

圖4 PTEN 在癌旁組織中的陽性表達(dá)(Elivision 法×400)

圖5 PTEN 在胃癌組織中的陰性表達(dá)(Elivision 法×100)

圖6 PTEN 在癌組織中的低表達(dá)(Elivision 法×400)

本研究顯示，胃癌組織中COX-2 的表達(dá)陽性率為70.00%，較癌旁組織中COX-2 的表達(dá)明顯升高，且與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，該研究提示COX-2 可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，可能是胃癌發(fā)生的一個(gè)早期事件和預(yù)后不良的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示胃癌中PTEN 的陽性表達(dá)率(41.3%)顯著低于正常胃組織(80.0%)(P＜0.01)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中PTEN 表達(dá)明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。這與Ettl 等在涎腺癌中的研究結(jié)果一致，推測PTEN 蛋白可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移有抑制作用，是胃癌轉(zhuǎn)移的負(fù)相關(guān)因子。

綜上所述，抑癌基因PTEN 的缺失表達(dá)和COX-2 的過表達(dá)在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用。胃癌組織中與正常組織中PTEN 基因的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，胃癌組織中與正常組織中COX-2 基因表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能說明胃癌的發(fā)生與發(fā)展和這兩種基因密切相關(guān)。COX-2 與PTEN 在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明這兩因子與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤的進(jìn)展中起到一定的負(fù)相關(guān)作用。但PTEN 如何在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中調(diào)控COX-2 因子仍有待進(jìn)一步研究。對(duì)COX-2 和PTEN 的深入探討有望為胃癌發(fā)病機(jī)制的研究及治療提供新靶點(diǎn)。聯(lián)合檢測PTEN 和COX-2 蛋白表達(dá)可能成為胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測指標(biāo)及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。

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